Исследование гистологических особенностей реакции печени при использовании новых образцов полимерных кровоостанавливающих материалов в эксперименте in vivo.

Полный текст

Важнейшими задачами современной хирургии являются: обеспечение надёжного гемостаза при оперативных вмешательствах и минимальная кровопотеря при травме внутренних органов, а также разработка и внедрение в практическое здравоохранение эффективных орган- и кровосберегающих технологий [1]. При травмах живота наиболее часто повреждаются паренхиматозные органы (печень, селезёнка, почки, поджелудочная железа), что приводит к значительной кровопотере и, как следствие, росту летальности. Травмы паренхиматозных органов живота во многих случаях носят множественный характер, сочетаются с повреждением органов и систем других анатомических областей, сопровождаются травматическим и геморрагическим шоком, что приводит к нарушениям в системе гемостаза вплоть до развития ДВС-синдрома и тяжелых гипокоагуляционных состояний [2, 3]. Травматические повреждения печени по тяжести течения, сложности диагностики, лечения, высокой летальности обоснованно считают наиболее опасными среди травм органов брюшной полости. Несмотря на достижения науки, в XXI веке состояние больного с травмой печени в 75% случаев осложняется развитием шока. Диапазон методов остановки кровотечения из паренхиматозных органов продолжает расширяться и в настоящее время [4, 5]. Среди них выделяют недавноразработанные методики, такие как сдавление печеночно-дуоденальной связки кетгутовой сеткой, наложение гемостатических швов, применение кровоостанавливающих имплантов различного химического состава, фармакологические методы гемостаза, а также резекции участка печени. Однако, все эти методы не в полной мере отвечают требованиям современной медицины [6, 7]. Так, требования к гемостатическим имплантам высоки – они должны быстро останавливать кровотечение (1-2 минуты), оказывать антисептическое действие, предотвращать послеоперационные осложнения, стимулировать регенерацию тканей поврежденного органа, обладать выраженной иммунологической инертностью к тканям, быть биодеградируемыми, атравматичными и удобными в использовании [8, 9, 10]. Согласно личному опыту и опираясь на данные литературу можно утверждать, что гемостатические импланты на основе производных целлюлозы превосходят по своим свойствам применяемые в клинике коллагеновые губки. Последние представляют собой чужеродный белок, по сути являющийся ксенотрансплантатом, способным вызывать выраженные, в том числе аллергиические иммунные реакции. Кроме того, данные импланты изготовлены из раствора коллагена, полученного из кожи и сухожилий крупного рогатого скота, и могут быть инфицированы вирусами и прионами, а единственный способ стерилизации (автоклавирование при 134°, 1 час) приведет к потере свойств аппликационного материала [11, 12]. Гемостатические импланты на основе целлюлозы обладают высокой биологической инертностью, кровоостанавливающей и противоспаечной активностью [13]. Однако, в литературе скудно представлены данные о кровоостанавливающих свойствах апплиационных материалов на основе карбоксиметилцеллюлозы в сочетании с химическими веществами, которые могут усилить гемостатические свойства имплантов, что повысит эффективность их использования в клинической практике.
Цель
Оценка гистологических особенностей печени при использовании новых образцов полимерных кровоостанавливающих материалов в эксперименте in vivo.
Материалы и методы
В качестве материалов исследования были использованы кровоостанавливающие губки на основе натрий-карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) (разработанные совместно с ООО «Линтекс», г. Санкт-Петербург, Россия) без и с добавлением лекарственных средств, а также губка коллагеновая «Белкозин» (ОАО «Лужский завод «Белкозин», г. Луга, Россия).
В качестве объекта исследования были выбраны половозрелые самцы кроликов породы Советская шиншилла (масса 2,3-2,5 кг), прошедшие карантин и содержащиеся в условиях экспериментально-биологической клиники ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. Все лабораторные животные в количестве 30 особей были разделены на 5 экспериментальных групп по 6 особей в каждой:
Группа №1 – контроль (интактная печень животных);
Группа №2 – модель травмы (производили моделирование травмы, остановку кровотечения с помощью аппликационных гемостатических имплантов не осуществляли);
Группа №3 – группа с использованием губки на основе Na-КМЦ;
Группа №4 – группа с использованием губки на основе Na-КМЦ с добавлением аминокапроновой кислоты (Na-КМЦ+АМК);
Группа №5 – группа с использованием губки на основе Na-КМЦ с добавлением ацетилсалициловой кислоты (Na-КМЦ+АСК);
Группа №6 – группа с использованием губки на основе Na-КМЦ с добавлением аминоуксусной кислоты (Na-КМЦ+АУК);
Группа №7 – группа с использованием гемостатической коллагеновой губки «Белкозин» (производитель: ОАО «Лужский завод «Белкозин», г. Луга, Россия).
Премедикацию лабораторным животным осуществляли препаратами Хлоропирамин (внутримышечно 0,4 мг/кг), Платифиллин (подкожно 0,07 мг/кг), Кеторол (внутримышечно 0,1 мл), Ксила (внутримышечно 0,2 мл/кг). Все процедуры на животных проводились под общей ингаляционной анестезией (наркозный аппарат R340 Isoflurane, RWD Life Science, производитель: Hi Tech North Rd, Nanshan Dist., Китайская Народная Республика), концентрация изофлюрана (производитель: АО «Бакстер», США) во вдыхаемой газовой смеси – 3%, поток воздуха – 0,8 л/мин) с соблюдением международных и отечественных норм гуманного обращения с лабораторными животными: Директива 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, приказ Минздрава России №199н от 01 апреля 2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», приказ Министерства здравоохранения СССР №755 от 12 августа 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» и пр.
В стерильных условиях операционного блока лаборатории экспериментальной хирургии и онкологии научно-исследовательского института экспериментальной медицины ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России в экспериментальных группах животным производили срединную лапаротомию и моделировали поверхностную плоскостную травму печени. Травму наносили при помощи специальной пластинки (Липатов В.А. и др., 2010), имеющей «окно» размерами 7×12 мм. В момент приложения усилия на пластинку ткани органа, возвышающиеся в ее окне, резецировали скальпелем, проводя им параллельно ее плоскости, в результате чего развивалось поверхностное паренхиматозное кровотечение, которое останавливали наложением образцов местных кровоостанавливающих материалов размерами 2×2 см. После достижения гемостаза лапаротомную рану послойно ушивали узловыми швами. В раннем послеоперационном периоде (первые сутки) животные получали антибиотик широкого спектра действия – Цефтриаксон внутримышечно по 20 мг/кг.
Выведение животных из эксперимента осуществлялось методом передозировки наркоза на 14-й день после операции. Производили аутопсию травмированного участка печени вместе с имплантированным гемостатическим средством. По стандартной методике изготавливали парафиновые блоки и гистологические микропрепараты, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Производили микроскопирование (увеличение 40 крат) – медицинский микроскоп МИКМЕД-6 (производитель АО «ЛОМО», г. Санкт-Петербург, Россия) и фотографирование с помощью C-mount (резьбовое соединение типа C) камеры E3CMOS12000KPA на основе сенсора Sony IMX226.  На полученных микрофотографиях измеряли (в пикселях – px) толщину капсулы, размер центральных вен печени, площадь гепатоцитов и их ядер, а также количество двухъядерных гепатоцитов.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением методик описательной и вариационной статистики. Производили расчет средних арифметических, стандартных отклонений и средних ошибок средних. В связи с малой выборкой (n=30) в экспериментальных группах и ненормальным распределением выборки по Колмогору-Смирнову для определения достоверности отличий средних применяли критерий Даннета. В качестве программной среды для обработки данных использовали программы Statistica (версия 6.0) и Biostatistics (версия 4.03). Статистически достоверными считались различия средних величин при допустимом для медико-биологических исследований уровне p≤0,05.
Результаты и их обсуждение
При оценке гистологических препаратов, полученных от животных группы №2 были отмечены дистрофические и некробиотические изменения гепатоцитов, декомплексирование печеночных балок (рис.1)
По сравнению с контрольной группой в группе №2 количество двуядерных гепатоцитов увеличено (10,67). Имеются изменения площади (в группе №1 7056,12 px; в группе №2 – 2976,04 px) гепатоцитов и их ядер (в группе №1 2118,72 px; в группе №2 – 452,39) – уменьшение в 3 раза в сравнении с группой №1, а площадь центральной вены в группе № 1 составила 6027,95 px, в группе №2 – 25573,18 (табл. 1).
Толщину капсулы печени в группе № 1 составляет один слой клеток (1,12 px). В местах моделирования травмы (группа № 2) наблюдается формирование разной и превышающей в десятки раз по толщине и структурной организации соединительнотканной капсулы равной 66,51 px (рис.2).
При морфологическом исследовании микропрепаратов от животных группы №6 обнаружено, что площадь гепатоцитов по сравнению с контрольной группой и с группами других имплантов на основе Na-КМЦ (группы №3, №4, №5) меньше в 4,8 раз (p≤0,05), имеют более округлую форму. В свою очередь, ядра клеток печени значительно меньших размеров (в 5,3 раза, p≤0,05) по сравнению с контролем. А количество двуядерных гепатоцитов, по сравнению с нормой и группами, в которых были использованы образцы других имплантов из Na-КМЦ, больше в 2,5 раза (p≤0,05), что свидетельствует о течении процессов регенерации тканей печени (рис. 3). В группе №6 отмечается значительное увеличение диаметра центральной вены печени в 5,4 раз (p≤0,05).
Толщина капсулы в группе №6 составила в среднем 18,34±6,71 px (в 17 раз больше, чем в группе № 1), это свидетельствует об активном течении пролиферативных процессов и рубцевании поврежденного участка паренхимы (рис.4). Относительно группы №3 толщина капсулы в группе №4 меньше в 3,1 раза.
В группе №7 площадь гепатоцитов и их ядер по сравнению с контрольной группой и с группами других имплантов (группы №3-№6) меньше в 4,2 раз (p≤0,05) (рис.5). Статистически значимых различий с группой «Модель травмы» нет. В данной группе отмечается увеличение количества двуядерных гепатоцитов по сравнению с группой № 1, а с группами №2-№6 в 2,5 раза (p≤0,05), что также свидетельствует об активном течении процессов регенерации в тканях травмированного органа, которые простимулированы продуктами биодеградации коллагенового импланта.
Толщина капсулы в группе №7 составила в среднем 7,69 px, что достоверно меньше, чем в группах №2-№6 и больше значения контрольной группы в 6 раз (рис.6).
Оценивая изменения площади гепатоцитов следует отметить, что различия в группах №3, №7 оказались статистически незначимыми по сравнению с группой №1. Показатели групп №4 и № 5 максимально приближены к показателям группы №1, а увеличение площади гепатоцитов в группе №3 относительно значений этого же показателя группы №1 статистически значимо. Таким образом, можно предполагать, что наибольшее влияние на гипертрофию гепатоцитов и регенерацию ткани печени оказали импланты на основе Na-КМЦ. Аналогично площади гепатоцитов, различие площади их ядер в группах №6, №7 статистически незначимы по сравнению с группой №1. В группах №6 и № 5 площадь ядер достоверно увеличена, но не достигает значений контрольной группы. Из этого можно предположить, что на 14-е сутки после имплантации гемостатических средств метаболические процессы в гепатоцитах не были восстановлены в полном объеме, но имеют явную положительную тенденцию к регенерации паренхимы. Наибольшее статистически значимое увеличение толщины капсулы по сравнению с группой № 1, группой №2 и №3 наблюдалось в группе №4. Показатели, наиболее приближенные к нормальной толщине капсулы в один слой клеток, были отмечены в группе №7.
Площадь центральной вены достоверно увеличена по сравнению с контрольной группой в группах №2, №3 и №6. В группах №3, №7 значения в наибольшей степени приближены к норме, что может свидетельствовать о восстановлении нормального венозного оттока после моделирования травмы и наложения локальных гемостатических средств в этих группах.
Количество двуядерных гепатоцитов по сравнению с нормой, группой №4 и группой №1 достоверно выше в группах №6 и №7. Это свидетельствует об увеличении пролиферативной активности в тканях печени.
Заключение
Из вышесказанного следует, что значительных гистологических перестроек, изменений морфологической структуры (площади гепатоцитов, их ядер, толщины капсулы и центральной вены, количество двуядерных гепатоцитов) в местах травмы и имплантации тестируемых образцов фактически не отмечалось при использовании гемостатических имплантов экспериментальных групп №3-№6 (кровоостанавливающие локальные средства на основе Na-КМЦ с добавлением аминокапроновой, ацетилсалициловой и аминоуксусной кислот). Стандартные морфологические реакции в виде воспаления и разрастания соединительной ткани при применении хирургических материалов на основе Na-КМЦ выражены незначительно при оценке их морфометрическим способом, поскольку данный полимер практически иммунологически инертен.

Об авторах

Вячеслав Александрович Липатов

ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, г. Курск

Email: drli@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6121-7412
SPIN-код: 1170-1189
Scopus Author ID: 6603948707
ResearcherId: D-8788-2013

д.м.н., профессор, профессор кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии

Россия, 305041 г. Курск, ул. К.Маркса, 3, Российская Федерация

Сергей Викторович Лазаренко

ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, г. Курск

Email: dok.lazarenko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7200-4508
SPIN-код: 1723-9128
ResearcherId: Y-9451-2018

к.м.н., ассистент кафедры онкологии

Россия, 305041 г. Курск, ул. К.Маркса, 3, Российская Федерация.

Дмитрий Андреевич Северинов

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: dmitriy.severinov.93@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4460-1353
SPIN-код: 1170-1189
Scopus Author ID: 57192996740
ResearcherId: G-4584-2017

ассистент кафедры анатомии человека

Россия

Анастасия Валерьевна Тарасова

ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, г. Курск

Email: tarasova.anastaya9999@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1715-229X
SPIN-код: 8645-6468
ResearcherId: D-3175-2019

студентка

Россия, 305041 г. Курск, ул. К.Маркса, 3, Российская Федерация.

Список литературы

Дополнительные файлы