Влияние ципрофлоксацина на динамику формирования биопленок штаммами Staphylococcus Epidermidis , выделенными при имплантат-ассоциированной инфекции

Полный текст

Обоснование

Имплантат-ассоциированное воспаление после тотального эдопротезирования крупных суставов является наиболее серьезным осложнением, в значительной мере ухудшающим результаты хирургического вмешательства и требующим больших материальных затрат на лечение пациента, частота перипротезной инфекции (ППИ) колеблется около 2-4,5% после первичного эндопротезирования [1, 2]. Наиболее частыми этиологическими агентами имплантат-ассоциированной инфекции в травматологии и ортопедии являются микроорганизмы рода Staphylococcus, частота выделения которых, по данным разных авторов, составляет 35-90% [3, 4].

Сложности диагностики и лечения имплантат-ассоциированного воспаления связаны с переходом ее возбудителей в сессильную форму и формированием микробной биопленки, что снижает информативность традиционных микробиологических методов диагностики и ограничивает спектр эффективных антимикробных препаратов для лечения ППИ [5]. По данным различных исследователей, ципрофлоксацин и другие представители фторхинолонов относят к высокоэффективным антибиотикам при лечении инфекций, связанных с формированием микробной биопленки [6].

Однако существуют исследования, рассматривающие предшествующую терапию ципрофлоксацином как фактор риска возникновения стафилококковой перипротезной инфекции, вызванной полирезистентными, в том числе, метициллинрезистентными штаммами, что связано с индукцией фторхинолонами продукции фибронектин- связывающих белков, являющихся факторами адгезии стафилококка, приводящими к формированию микробных биопленок [7, 8].

В настоящее время стратегия этиологической диагностики и антибактериальной терапии имплантат-ассоциированных осложнений в травматологии и ортопедии нуждается в существенном пересмотре в связи появлением данных об основной роли биопленок в патогенезе имплантат-ассоциированной инфекции

Цель

Изучить влияние субингибирующих и терапевтических доз ципрофлоксацина на формирование биопленок штаммами Staphylococcus epidermidis, выделенными при имплантат-ассоциированной инфекции.

Методы

В работе изучено 15 штаммов St. epidermidis, полученных от 83 пациентов с глубокой перипротезной инфекцией после первичного эндопротезирования коленного сустава, получавших лечение в НИИТОН СГМУ в 2018-2019 гг., диагноз был подтвержден клиническими, инструментальными и лабораторными методами исследования. Для микробиологического исследования использовали не только традиционные микробиологические методы: исследование отделяемого ран, аспирата из полости сустава, но и методы, предполагающие деструкцию биопленки – гомогенизированные тканевые биоптаты, жидкость после соникации удаленных эндопротезов, что позволяет повысить информативность микробиологической диагностики, особенно в случае малосимптомного течения перипротезной инфекции. Идентификацию возбудителей осуществляли с использованием анализатора BD BBL™ Crystal™ AutoReader (Becton Dickinson, США)

Готовили 18-часовую суспензию клеток St. epidermidis 5·10⁶ КОЕ/мл в ГРМ-бульоне с глюкозой, которую использовали в качестве положительного контроля. К суспензии добавляли раствор ципрофлоксацина (0,01-3,0 мкг/мл) в ГРМ-бульоне с глюкозой. Стерильный ГРМ-бульон использовали в качестве отрицательного контроля.

Рассчитанные концентрации ципрофлоксацина смешивали с бактериальной суспензией в стерильных пробирках, вносили в лунки по 150 мкл, планшеты инкубировали при 37°C в течение 24 часов, после чего питательную среду с планктонной культурой переносили в стерильный 96-луночный планшет для измерения оптической плотности (планктонная культура 1). В лунки добавляли 0,01%-ный раствор кристаллического фиолетового на 30 минут, затем краситель удаляли, лунки трижды промывали 0,9%-ным раствором NaCl, добавляли по 200 мкл спирта для экстрагирования генцианового фиолетового на 30 мин. Затем измеряли оптическую плотность элюатов на на микропланшетном спектрофотометре (Anthos 2020, Австрия) при длине волны 540 нм.

Также изучено влияние выбранных концентраций ципрофлоксацина на предварительно сформированные биопленки, для чего на первом этапе в лунки полистиролового планшета вносили суспензию клинических штаммов S. epidermidis  для формирования биопленок, инкубировали 24 часа при 37°C, планктонные клетки переносили в стерильный планшет для измерения оптической плотности (планктонная культура 2), промывали стерильным 0,9% раствором NaCl. На втором этапе в лунки с предварительно сформированной микробной биопленкой добавляли ГРМ-бульон, содержащий рассчитанные концентрации ципрофлоксацина (от 0,01 мкг/мл до 3 мкг/мл), инкубировали 24 часа при 37°C, проводили окраску микробной биопленки по стандартной методике и определение оптической плотности спиртовых элюатов генцианового фиолетового на спектрофотометре, данные оптической плотности представлены в таблице 1 и на рисунке1.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 10.0. Проверку вариационных рядов на нормальность распределения выполняли по критерию Шапиро – Уилка. При статистическом анализе использовали непараметрические методы исследования с вычислением средней (M), стандартного отклонения средней (±SD), медианы (Me), 25-го и 75-го квартилей (Q). Для сравнения трех независимых выборок использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела – Уоллиса. Для сравнения двух независимых выборок использовали тест Манна-Уитни. Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты

Проведено микробиологическое исследование 134 образцов клинического материала от 83 пациентов с подтвержденной ППИ: 37,5% образцов не дали бактериального роста, в 27,5% случаев выявлены микробные ассоциации, в 67% случаев - монокультура. Отмечено преобладание бактерий рода Staphylococcus – 34, 1% составили штаммы St. epidermidis и 27,3%- штаммы St. aureus. Для исследования влияния различных концентраций ципрофлоксацина на планктонные и биопленочные культуры отобрано 15 штаммов St. epidermidis, выделенных из монокультуры.

Для исследования влияния различных концентраций ципрофлоксацина на планктонные и биопленочные культуры отобрано 15 штаммов St. epidermidis, выделенных из монокультуры. Установлено, что концентрация 0,01 мкг/мл снижала оптическую плотность суспензии клинических штаммов на 50% по сравнению с контролем, концентрация 0,03 мкг/мл – на 90%, 0,05 мкг/мл приводила к полному подавлению роста планктонной формы клинических штаммов St.epidermidis (планктонная культура 1), данные представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Влияние ципрофлоксацина на рост планконных клеток и формирование биопленок клиническими штаммами St. epidermidis / Fig. 1. Ciprofloxacin effect on the growth of plankton cells and biofilm formation by St. epidermidis clinical strains

 

Субингибирующие и ингибирующие для планктонных клеток концентрации ципрофлоксацина были использованы для изучения их влияния на процессы биопленкообразования. Значения оптической плотности элюатов генцианового фиолетового, полученные при формировании биопленки в присутствии рассчитанных концентраций ципрофлоксацина, и влиянии ципрофлоксацина на предварительно сформированную биопленку, представлены на рисунке 1 и в таблице 1.

 

Таблица 1. Оптическая плотность экстрактов генцианвиолета, полученных при формировании биопленки клиническими штаммами St. epidermidis

Группа	Конц-ция ципрофлоксацина, мкг/мл	Формирование биопленки	Предформированная биопленка
1	Контроль без антибиотика	0,281 (0,230; 0,427) Р1-3=0,000261 Р1-4=0,000192	0,479 (0,419; 0,543) Р1-2=0,000527
2	0,01	0,607 (0,456; 0,729) Р2-6=0,005683 Р2-7=0,000012	0,854 (0,711; 0,978) Р*=0,017842
3	0,03	0,789 (0,679; 0,930) Р3-5=0,039910 Р3-6=0,000006 Р3-7=0,000001	0,911 (0,825; 0,978) Р3-1=0,000021
4	0,05	0,803 (0,712; 0,985) p4-5=0,031869 p4-6=0,000004 p4-7=0,000001	0,897 (0,856; 1,134) p4-1=0,000010 р4-6=0,000043
5	0,1	0,428 (0,342; 562) p5-7=0,014042	0,759 (0,562; 0,834)
6	1	0,219 (0,156; 0,278)	0,485 (0,345; 0,567) Р6-2=0,001775
7	3	0,145 (0,089; 0,205)	0,456 (0,389; 0,589) p7-2-=0,00026 p7-3-=0,000009 p7-4-=0,000004

Примечания: в таблице приведены значения медианы и квартилей (25 %; 75 %); p - показатель достоверности различий групп при использовании различных концентраций ципрофлоксацина; p^*- статистические различия между влиянием ципрофлоксацина в концентрации 0,01мкг/мл на формирование биопленки и предформированную биопленку

 

Table 1. Optical density of gentian violet extracts obtained at biofilm formation by St. epidermidis strains

Group	Concentration, µg/mL	Biofilm formation	Preliminary-formed biofilm
1	Control without antibiotic	0,281 (0,230; 0,427) p1-3=0,000261 p1-4=0,000192	0,479 (0,419; 0,543) p1-2=0,000527
2	0,01	0,607 (0,456; 0,729) p2-6=0,005683 p2-7=0,000012	0,854 (0,711; 0,978) p*=0,017842
3	0,03	0,789 (0,679; 0,930) p3-5=0,039910 p3-6=0,000006 p3-7=0,000001	0,911 (0,825; 0,978) p3-1=0,000021
4	0,05	0,803 (0,712; 0,985) p4-5=0,031869 p4-6=0,000004 p4-7=0,000001	0,897 (0,856; 1,134) p4-1=0,000010 р4-6=0,000043
5	0,1	0,428 (0,342; 562) p5-7=0,014042	0,759 (0,562; 0,834)
6	1	0,219 (0,156; 0,278)	0,485 (0,345; 0,567) p6-2=0,001775
7	3	0,145 (0,089; 0,205)	0,456 (0,389; 0,589)            p7-2-=0,00026 p7-3-=0,000009 p7-4-=0,000004

 

Note: the table shows median and quartile values (25 %; 75 %); p – confidence index for various groups when using various ciprofloxacin concentrations; p^*– statistical difference between the effect of 0.01 µg/mL ciprofloxacin concentration on biofilm formation and preliminary-formed biofilm

 

 

Концентрация ципрофлоксацина 0,01 мкг/мл вызывала повышение оптической плотности элюатов генцианового фиолетового в 2,16 раза у формирующейся биопленки по отношению к контролю без добавления антибиотика. Ципрофлоксацин в концентрациях 0,03-0,05 мкг/мл достоверно (р=0,001) увеличивал интенсивность биопленкообразования по сравнению с контролем, что отражено в таблице 1.

При дальнейшем увеличении концентрации ципрофлоксацина до 1,0 мкг/мл наблюдали статистически достоверное (p<0,05) уменьшение оптической плотности элюатов красителя по сравнению с максимальными уровнями. Концентрация антибиотика 3 мкг/мл приводила к снижению оптической плотности элюатов ниже показателей контроля без антибиотика, следовательно, ципрофлоксацин в этой дозе ингибирует формирование биопленок.

Также в таблице 1 приведены результаты влияния выбранных концентраций ципрофлоксацина на биопленки, предварительно сформированные в полистироловых планшетах в течение 24 часов. В лунках положительного контроля без добавления антибиотика отмечали повышение оптической плотности суспензии планктонных микроорганизмов вследствие активного диспергирования планктонных форм из биопленки и тенденцию к увеличению оптической плотности элюатов генцианового фиолетового по сравнению с этапом формирования биопленки в течение 24 часов, что свидетельствовало о дальнейшем росте биопленки.

Концентрации ципрофлоксацина 0,01-0,03 мкг/мл обладали субингибирующим действием на планктонную форму St. epidermidis. При концентрации антибиотика 0,5 мкг/мкл и  выше отмечали полное подавление роста планктонных бактерий (плактонная культура 2), результаты отражены на рисунке 1.

При изучении влияния рассчитанных концентраций антибиотика на предварительно сформированную биопленку установлено, что ципрофлоксацин в концентрациях 0,01-0,05 мкг/мкл статистически достоверно (р=0,001) увеличивал оптическую плотность элюатов красителя по сравнению с контролем, что свидетельствовало о стимулирующем влиянии этих концентраций антибиотика на дальнейший рост предформированной биопленки.

Концентрация ципрофлоксацина 1,0-3,0 мкг/мл вызывала статистически достоверное (p<0,05) уменьшение оптической плотности элюатов красителя по сравнению с максимальным уровнем, следовательно, можно говорить об отсутствии дальнейшего стимулирующего действия на рост предформированной биопленки. Однако, следует отметить, что влияние даже максимально используемой концентрация ципрофлоксацина (3 мкг/мл) не вызывала деструкции предформированной биопленки, оптическая плотность элюатов красителей оставалась выше, чем у предформированной биопленки без воздействия ципрофлоксацина.

Также необходимо отметить статистически достоверное (р=0,018) увеличение массы предформированной микробной биопленки по сравнению с формирующейся биопленкой при концентрации ципрофлоксацина 0,01 мкг/мл.

Обсуждение

Обнаружен дозозависимый эффект ципрофлоксацина в отношении клинических штаммов S. epidermidis: низкие концентрации (0,01-0,05 мкг/мл) ингибируют размножение планктонных форм, но обладают стимулирующим влиянием на формирование и дальнейшее увеличение массы предварительно сформированных микробных биопленок. При увеличении концентрации ципрофлоксацина до 1,0-3,0 мкг/мл отмечали угнетение формирования биопленок S. epidermidis, однако не наблюдали деструкции предварительно сформированных микробных биопленок.

Стимулирующее влияние низких доз ципрофлоксацина на формирование микробных биопленок S. epidermidis обусловлено тем, что в присутствии антибиотика бактерии могут существовать только под защитой полисахаридного матрикса, обладающего избирательной проницаемостью и не пропускающего молекулы ципрофлоксацина [5, 8]. Активация биопленкообразования под влиянием низких доз ципрофлоксацина, позиционируемого рядом авторов как препарата, эффективно разрушающего биопленки [6], имеет большое практическое значение для назначения адекватной этиотропной терапии. В клинической практике ципрофлоксацин используется в дозах, создающих в крови концентрацию 2,1–4,6 мкг/мл активного вещества [2], однако следует учитывать, что в очаге воспаления вокруг импланта концентрация антибиотика значительно ниже, чем в сосудистом русле, что создает предпосылки для роста бактериальных пленок и хронизации инфекции.

В случаях перипротезной инфекции с уже сформировавшейся биопленкой низкие дозы ципрофлоксацина способствуют ее дальнейшему росту [9, 10], использование терапевтических концентраций ограничивает дальнейшее увеличение биомассы микробной пленки, однако не вызывает ее деструкции. В случаях хронической биопленочной перипротезной инфекции эффективная антибиотикотерапия затруднена, борьба с инфекцией должна осуществляться хирургическими методами – заменой инфицированного эндопротеза [10, 11].

Заключение

Особенности патогенеза биопленочных инфекций, к которым относят имплантат-ассоциированную инфекцию, требуют изменения подходов к их диагностике и этиотропной терапии. Современные концепции антибактериальной терапии перипротезной инфекции должны включать определение не только минимальной подавляющей концентрации планктонной формы возбудителя, но и концентраций, подавляющих рост биопленки, а также учитывать влияние антибактериальных препаратов на биопленкообразование.

 

 

 

 

Об авторах

Ирина Владимировна Бабушкина

Научно-исследовательский институт травматологии, ортопедии и нейрохирургии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского, Российская Федерация
 

Автор, ответственный за переписку.
Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6740-1050
SPIN-код: 8777-6795

Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований

Россия, 410002,ул. Чернышевского, 148, Российская Федерация

Ирина Александровна Мамонова

Научно-исследовательский институт травматологии, ортопедии и нейрохирургии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского

Email: sarniito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3941-4334
SPIN-код: 7957-2955
Scopus Author ID: https://orcid.org/0000-0003-3941-4334

Кандидат биологических наук, младший научный сотрудник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований

Россия, 410002, Россия, ул.Чернышевского, 148

Владимир Юрьевич Ульянов

Научно-исследовательский институт травматологии, ортопедии и нейрохирургии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского

Email: sartiito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9466-8348
SPIN-код: 8280-3339
Scopus Author ID: 0000-0002-9466-8348

Доктор медицинских наук, заместитель директора по научной и инновационной деятельности

Россия, 410002, Россия, Саратов, ул.Чернышевского,148

Сергей Петрович Шпиняк

Научно-исследовательский институт травматологии, ортопедии и нейрохирургии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского, Российская Федерация

Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0345-6287
SPIN-код: 6540-1764

К.м.н., младший научный сотрудник отдела инновационных проектов в травматологии и ортопедии научно-исследовательского института травматологии, ортопедии и нейрохирургии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского

Россия, 410002, Саратов, ул.Чернышевского, 148, Российская Федерация

Александр Сергеевич Бондаренко

 Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского

Email: sarniito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6345-1851
SPIN-код: 6719-4520

Заместитель декана лечебного факультета и факультета клинической психологии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И.Разумовского

Россия, 410012, Россия, Саратов, ул.Б. Казачья, 112

Список литературы

Дополнительные файлы