Экспериментальное исследование эффективности нового гемостатического композита на основе геля натрий карбоксиметилцеллюлозы и аминокапроновой кислоты после частичной спленэктомии у крыс

Полный текст

Обоснование. Одними из наиболее частых осложнений травм брюшной полости являются повреждения и разрывы селезёнки, в 5-41% случае приводящие к летальным исходам [1, 2]. Ведущими стратегиями при хирургических вмешательствах на селезёнке являются достижение в кратчайшие сроки эффективного гемостаза и соблюдение органосохраняющей тактики во избежание воспалительных и инфекционных осложнений, связанных с потерей иммунологической функции селезёнки [2-4]. Важное значение в лечении травм селезёнки отводится использованию новейших средств гемостаза. Всё большее признание получают местные кровоостанавливающие препараты, к преимуществам которых относят простоту применения, высокую эффективность и минимум побочных эффектов [5]. Механизм действия применяемых на сегодняшний день местных гемостатических средств заключается в имитации и стимуляции этапов естественного гемостаза или в ускоренном формировании фибринового сгустка, минуя эти этапы [6]. Чаще всего местные гемостатические препараты представлены комплексом сорбента (адъюванта) и тромбинового компонента. В роли сорбента может выступать желатин, который набухает при контакте с кровью или тканевыми жидкостями, замедляя их истечение. Коллагеновые матриксы осаждают на своей поверхности тромбоциты и формируют сгустки крови. Похожий механизм действия у гемостатиков на основе окисленной целлюлозы. К тромбиновым компонентам, непосредственно запускающим коагуляционный каскад, относят тромбин, фибриноген и некоторые факторы свёртывания (например, XIII) [7]. Универсального средства для остановки паренхиматозного кровотечения в настоящее время не существует. Практически все предложенные препараты, выпускающиеся в виде губок, клея, лака или геля, не лишены недостатков, наиболее частым и опасным из которых является спаечный процесс  [7].

В связи с этим, целью настоящего исследования стала разработка нового местного гемостатического средства с противоспаечной активностью, изучение его кровоостанавливающей эффективности и влияния на морфологические изменения в селезёнке с акцентом на анализ лимфоидных структур и активность Т-хелперов, преобладающих в Т-зависимых зонах белой пульпы и наиболее остро реагирующих на спленэктомию [4]. В качестве матриксной основы для нового гемостатика был выбран гель натрий карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ), который можно рассматривать в качестве аналога гемостатических материалов на основе окисленной целлюлозы. Более того, гель натрий карбоксиметилцеллюлозы в 4%-ной концентрации, известный как «Мезогель», обладает противоспаечным эффектом [8]. Экспериментально нами была доказана целесообразность его применения в виде 6% концентрации и преимущество использования в форме геля. Для усиления гемостатических свойств в 6%  Na-КМЦ добавлена 5% аминокапроновая кислота (АК).  

Материал и методы исследования. В качестве экспериментальных  животных использовали крыс самцов линии Вистар массой 185-250 грамм, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.77 №755) и с рекомендациями Международного комитета по науке о лабораторных животных, поддержанных ВОЗ, директивой Европейского Парламента № 2010/63/EU от 22.09.10 «О защите животных, используемых для научных целей». Исследования проводились в трёх группах: 1) контрольная - без использования гемостатических средств, 2) с использованием стандартного противоспаечного геля Na-КМЦ 4% - «Мезогеля» и 3)  опытная группа с применением 6 % геля натрий карбоксиметилцеллюлозы с добавлением 5% аминокапроновой кислоты. Фирма-производитель гелей - ООО «Линтекс», г. Санкт-Петербург).

Для оценки кровоостанавливающего эффекта в остром эксперименте in vivo у 60 животных (по 20 в каждой группе) определяли время остановки кровотечения и величину кровопотери. Под масочным изофлюрановым наркозом  крысам выполняли срединную лапаротомию. Затем производили  резекцию переднего края селезенки стандартным способом, с помощью  трафарета в виде угольника, длина ребер последнего была равна 1 см, высота раны составляла 3 мм. Характер операционной раны способствовал получению массивного кровотечения. Под намеченную область раны подкладывали марлевую салфетку с заведомо известной массой и отграничивали от серозной жидкости брюшины с помощью полиэтиленовой пленки. На кровоточащую область раны наносили по 1 мл исследуемых гелеобразных препаратов.  После моделирования раны включали секундомер и останавливали его при отсутствии истечения крови ее из-под опытных образцов. Величину кровопотери определяли как разницу в весе марлевой салфетки до и после эксперимента. Достоверность различий сравниваемых величин определяли с вычислением среднего значения (М±σ) и использованием критерия Стьюдента.

В хроническом эксперименте у 27 крыс моделирование раны селезёнки и аппликация гемостатических средств, проводили, как описано выше. Из каждой группы (по 9 животных) на 3-и, 7-е и 14-е сутки выводили из эксперимента по 3 животных путем подачи в кювез углекислого газа. Выраженность спаечного процесса оценивали с помощью метода семантического дифференциала  [9]. Меньшие значения семантического дифференциала свидетельствовали о минимальной выраженности спаечного процесса в брюшной полости.

Для гистологического исследования фрагменты селезёнки экспериментальных животных, включающие область раны и аппликации гемостатических средств,  заливали в парафин по стандартной методике. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином для проведения морфометрического анализа и по Ван-Гизону для оценки выраженности фиброзных изменений. Под микроскопом с увеличением в 40 раз подсчитывали плотность расположения лимфоидных узелков. Площадь лимфоидных узелков и размеры герминативных центров определяли с помощью компьютерной программы ImageJ при увеличении в 40 раз. Используя колориметрические гистограммы, косвенно оценивали кровенаполнение селезёнки. Для иммуногистохимического окрашивания CD4+ Т-лимфоцитов использовали моноклональные антитела Anti-CD4 (M3350) (Glostrup, Дания). В качестве хромогена использовали диаминобензидин с последующим докрашиванием гематоксилином. Результаты этого исследования оценивали полуколичественно в арбитражных единицах по 5-ти балльной шкале, учитывая интенсивность окрашивания и количество положительно окрашенных клеток. Достоверность различий сравниваемых величин определяли с вычислением среднего значения (М±σ) и критерия Манна-Уитни (U). Различия считали статистически достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. В остром опыте время остановки кровотечения составило: в контрольной группе - 323,67±1,27 с; в группе 4% КМЦ «Мезогель» - 233±1,52 с; в исследуемой группе 6%Na-КМЦ+АК5% - 100,4±1,39 с. Доказано, что новый композит обладает выраженными кровоостанавливающими свойствами, сокращая время остановки кровотечения относительно контроля на 69 % (222,27 с) (р<0,01) и «Мезогеля» -  на 42% (132,76 с) (р<0,05). Более того, препарат значимо уменьшает кровопотерю при травме селезенки относительно контроля на 69 % (285,6 мг) (р<0,01), что значительно выше гигроскопичных свойств «Мезогеля», при аппликации которого сократить кровопотерю удалось лишь на 21 % (65,8 мг) (р<0,05). Исходные данные величины кровопотери: контрольная группа - 411,6±2,15 мг; 4% Na-КМЦ 345,8±2,13 мг; 6%Na-КМЦ+АК5% -126±1,62 мг.

В хроническом эксперименте выжили все животные.  У  животных, контрольной группы спаечный процесс был выявлен во всех случаях. На 3-и сутки коэффициент выраженности спаечного процесса составил 1,856±0,23 балла, был представлен сальниковыми спайками и занимал область манипуляции -  мезогастральную область. На 7-е сутки были выявлены  плоскостные и сальниковые спайки, иногда  деформировавшие край селезёнки или сужавшие диаметр кишечника, наблюдали единичные тракционные спайки. Коэффициент выраженности спаечного процесса составил 2,344±0,11 балла. На 14 сутки спаечный процесс занимал 80% брюшной полости. Преобладали тракционные, шнуровидные спайки, реже встречались плоскостные и сальниковые, отмечали выраженную деформацию внутренних органов. Коэффициент выраженности спаечного процесса составил 4,143±2,04 балла.

При исследовании животных с аппликацией нового композита 6%Na-КМЦ+ 5%АК и «Мезогеля» проявления спаечного процесса на 3 сутки отсутствовали. На 7 сутки после применения нового композита 6%Na-КМЦ+5% АК выраженность спаечного процесса была минимальной 0,481±0,277 балла, после использования 4 % Na-КМЦ («Мезогеля») - 0,326±0,163 балла, без значимых различий между данными группами, но достоверно относительно контрольной (р<0,05). Были выявлены лишь единичные сальниковые спайки, подходящие к постоперационному краю селезенки. На 14 сутки коэффициент спаечного процесса  значимо не увеличился. После применении 6% Na-КМЦ+ 5%АК он составил 0,486±0,278 балла, после аппликации «Мезогеля» – 0,641±0,32  балла. Вид спаек был аналогичным 7 суткам эксперимента. Достоверные различия между этими группами отсутствовали, что свидетельствует о том, что 6% Na-КМЦ+ 5%АК подобно «Мезогелю» демонстрирует наличие эффективной противоспаечной активности (р<0,05 относительно контроля).

Результаты гистологического исследования показали, что на 3 сутки после частичной спленэктомии белая пульпа на гистологических срезах представлена небольшим количеством (7-9) крупных лимфоидных узелков с нерезко выраженными границами. На 7 сутки количество лимфоидных узелков возрастает в 2-3 раза (р<0,05) и остаётся повышенным к 14 суткам эксперимента (р<0,01). Площадь лимфоидных фолликулов с 3 по 14 сутки достоверно не меняется (Рис. 1).

 

 

Рис. 1. Средние значения размеров лимфоидных узелков мкм².

Fig. 1. The average size of the lymphoid nodules μm2.

 

 

Количество CD4+ Т-лимфоцитов возрастает с 3 по 7 сутки и остаётся повышенным к 14 суткам (Рис. 2).

 

 

 

Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание CD4+ Т-лимфоцитов в селезёнке крыс после частичной спленэктомии (а, в, д) и при аппликации в этих условиях нового гемостатического композита на основе 6 % геля натрий карбоксиметилцеллюлозы и аминокапроновой кислоты (б, г, е) на 3-и (а, б), 7-ые (в, г) и 14-е (д, е) сутки эксперимента. Ув.400.

Fig. 2. Immunohistochemical staining of CD4 + T-lymphocytes in the rat spleen after partial splenectomy (a, c, e) and under the application of a new hemostatic composite based on 6% gel of sodium carboxymethyl cellulose and aminocaproic acid (b, d, f) on 3- and (a, b), the 7th (c, d) and the 14th (e, f) days of the experiment. Uv. 400.

 

В целом, изменения белой пульпы свидетельствуют об активизации иммунной функции селезёнки на 7 сутки эксперимента, что совпадает с динамикой воспалительного процесса и формированием спаек. На 14 сутки активность белой пульпы, судя по объёму лимфоидной ткани и количеству CD4+ Т-лимфоцитов, остаётся повышенной по сравнению с группами, где использовались гемостатические и противоспаечные препараты, и свидетельствует о большей интенсивности воспалительных процессов, связанных, в том числе, с обширным спаечным процессом. В паренхиме селезёнки фиброзные изменения отсутствовали. Однако развитие спаечного процесса, вовлекающего рядом расположенную поджелудочную железу, отмечено у всех животных этой экспериментальной подгруппы.

При использовании 4% геля натрий карбоксиметилцеллюлозы, известного как «Мезогель», достоверного изменения плотности лимфоидных фолликулов и их площади, с 3 по 14 сутки эксперимента не происходило. Однако, следует отметить, что на 7 сутки число лимфоидных узелков было в 2-3 раза меньше, чем в контрольной группе без использования гемостатических и противоспаечных средств. На 3 сутки площадь лимфоидных фолликулов была значимо ниже, чем в контроле (р<0,01), что свидетельствует о меньшей  активизации иммунного ответа селезёнки (Рис. 2). Более того, использование 4% геля натрий карбоксиметилцеллюлозы позволило предотвратить развитие спаечного процесса и снизить выраженность иммунного ответа со стороны селезёнки.   

В третьей группе животных, где на раневую поверхность селезёнки после резекции наносили новый композит, состоящий из 6% геля натрий карбоксиметилцеллюлозы и 5% аминокапроновой кислоты, размеры и количество лимфоидных фолликулов значимо снижались с 3 по 7 сутки эксперимента (р<0,01). Резко выраженное уменьшение размеров лимфоидных фолликулов на 7 сутки ассоциировалось с наибольшим количеством CD4+ Т-лимфоцитов по сравнению с 3-ми и 14-ми (р<0,01) сутками эксперимента.  Количество лимфоидных фолликулов и CD4+ Т-лимфоцитов снижалось к 14 суткам. Наибольшая активность белой пульпы в этой группе животных зафиксирована на 3 сутки эксперимента. Спайки, фиброзные изменения и признаки дегенеративных изменений селезёночной паренхимы отсутствовали, что косвенно свидетельствовало об отсутствии местных негативных эффектов нового гемостатического композита.                

При сравнительном анализе изменений в третьей группе с аппликацией нового композита выявлено, что на 14 сутки количество лимфоидных фолликулов достоверно ниже, чем в контрольной группе (р<0,05). Более того, при использовании нового композита на 3 (р<0,01) и на 7 (р<0,01) сутки площадь лимфоидных узелков была значимо ниже, чем в контроле, что свидетельствует об изначально меньшей выраженности иммунных реакций в селезёнке, связанных с послеоперационным воспалительным процессом (Рис. 2). Количество CD4+ Т-лимфоцитов на 7 сутки достоверно превышало значения контрольной группы (р<0,01). Однако, на 14 сутки содержание CD4+ Т-лимфоцитов достоверно снижалось. Таким образом, использование нового гемостатика позволяет не только уменьшить объём кровопотери и предотвратить развитие спаечного процесса, но и снизить реактивность белой пульпы, что приводит к отсутствию признаков выраженного воспаления. 

В современной хирургической практике комбинированный препарат подобного действия отсутствует. Несмотря на большой выбор твердых гемостатических форм (губки, пластины, клеи), эти средства, как любое инородное тело, являются пусковым механизмом спаечного процесса. Так, например, «Серджисель фибриллар» (surgicel fibrillar) – нетканый гемостатичекий препарат, согласно механизму действия, указанного в инструкции [10] вызывает окисление тканей организма, по сути, химический ожог, и запускает каскад образования соединительной ткани. С другой стороны, современные противоспаечные препараты, применяемые в клинике (глицерин, декстраны, гиалоурановая кислота, физиологический раствор и т.д.),  не способствуют остановки кровотечения [11]. Таким образом, новый композит обладает выраженными преимуществами, демонстрируя комбинированное гемостатическое и противоспаечное действие.  

Выводы:

1.Новый композит 6%Na-КМЦ+5% АК обладает выраженными кровоостанавливающими свойствами, значимо превосходя свой прототип – «Мезогель». Применение этого препарата достоверно снижает время кровотечения на 68% (222,27 с) и величину кровопотери на 69 % (285,6 мг) (р<0,01).

2. 6%Na-КМЦ+5%АК снижает иммунологическую реактивность белой пульпы селезёнки, связанную с развитием воспалительных процессов в послеоперационном периоде, что является одним из ключевых моментов предотвращения развития спаечного процесса, как в области манипуляции, так и в брюшной полости в целом.
3. Препарат обладает высокой противоспаечной активностью. Выраженность спаечного процесса на 3 сутки эксперимента составила 0 баллов; на 7-е и 14-е сутки - была минимальной: 0,481±0,277 и 0,486±0,2778 балла соответственно (р<0,05). Противоспаечный эффект нового композита не отличался от такового у «Мезогеля».
4. Новый композит 6% Na-КМЦ + 5%АК может быть рекомендован для дальнейшего

клинического исследования, с целью использования в абдоминальной хирургии при операциях на селезенке, как препарат комбинированного действия.

Об авторах

Дарья Сергеевна Солдатова

Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: dascha22118@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9278-2737

ассистент кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии им. А. Д. Мясникова Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Россия, ул. К. Маркса, д.3, Курск, 305041, Российская Федерация

Александр Иванович Бежин

Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: abezin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3776-9449
SPIN-код: 1250-5549

д. м. н., профессор, заведующий кафедрой оперативной хирургии и топографической анатомии им. А. Д. Мясникова

Россия, г. Курск, ул. Карла Маркса д. 3

Татьяна Александровна Ишунина

Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ishunina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2743-7515
SPIN-код: 6334-5020

д. м. н., доцент кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии

Россия, г. Курск, ул. Карла Маркса д. 3

Список литературы

Дополнительные файлы