Экспериментальное моделирование язвенно-некротической стадии критической ишемии нижних конечностей

Полный текст

Критическая ишемия нижних конечностей имеет тенденцию к неуклонному росту. Если в 20 веке она регистрировалась у 500 человек на 100тыс населения, то в 21 веке – у 1000 человек, т.е. имеет место двукратный рост патологии [1]. Прямые реконструктивные операции на артериях нижних конечностей возможны лишь у 75-80% пациентов, что обусловлено многоэтажным поражением и отсутствием воспринимающего русла. В 20-25% случаев применяются консервативное лечение и методы непрямой реваскуляризации: введение клеток костного мозга в ишемизированную конечность, поясничная симпатэктомия, реваскуляризирующая остеотрепанация [2]. Изучение эффективности лекарственных средств и непрямой реваскуляризации проводится на экспериментальных моделях критической ишемии.

В литературе описан ряд способов моделирования острой и хронической ишемии конечности. В порядке агрессивности модели целесообразно выстроить следующим образом.

Наиболее простым является моделирование хронической ишемии конечностей путем наложения на подвздошную артерию кетгутовой нити в виде спирали с сужением просвета сосуда на ½ диаметра. Хроническая ишемия возникает постепенно в результате набухания кетгутовой нити, что приводит к дальнейшему сужению просвета сосуда [3]. Развития критической ишемии не возникает, т.к. кетгутовая лигатура рассасывается в течение 2-3 недель и кровоток восстанавливается.

Для изучения влияния аутологических клеток костного мозга на течение хронической ишемии зарубежными авторами предложена модель ишемии путем перевязки бифуркации бедренной артерии. Кровоток прекращался по поверхностной и по глубокой артерии бедра. Развивалась хроническая ишемия нижней конечности, при экспериментальном лечении которой было установлено, что наибольшей эффективностью обладают мононуклеарные клетки костного мозга [4].

Более агрессивная модель была создана путем наложения четырех лигатур на магистральные артерии и вены животных. Для прекращения артериального кровотока лигатуры накладывались на подвздошную, бедренную и подколенную артерии, а для затруднения венозного оттока – на бедренную вену. Между лигатурами иссекалась и удалялась бедренная артерия. Применение данной модели позволяет получить клиническую картину хронической ишемии третьей стадии: конечность выключалась из передвижения, кожные покровы становились бледные и холодные. Однако ишемический отек и трофические расстройства не возникали [5].

Для лечения трофических язв артериального происхождения была разработана экспериментальная модель, сочетающая создание ишемии задней конечности животного путем лигирования подвздошной артерии и нанесением 2-3 кожных ран на стопе. Хроническая ишемия в этом случае развивалась в легкой степени и раны быстро заживали [6].

Более агрессивной является модель с перекрытием кровотока путем наложения лигатур на артерии 1-го и 2-го порядка от наружной подвздошной до подколенной артерии и на бедренной артерии ниже бифуркации [7]. У экспериментальных животных развивалась клиника хронической ишемии конечности III стадии, но трофические расстройства отсутствовали из-за компенсации кровотока по «vasa vasorum».

Ранее в нашей клинике для изучения влияния различных фармакологических препаратов и аутоклеток костного мозга на течение хронической ишемии конечности предложена резекционная модель, суть которой заключалась в иссечении бедренной, подколенной и начальных отделов передней и задней большеберцовых артерий. Отходящие от артерий коллатерали первого порядка пересекали и лигировали [8]. Модель позволяла воспроизвести критическую хроническую ишемию мышц голени. Однако трофические расстройства развивались редко.

 Преимуществами представленных моделей являлась возможность в условиях эксперимента изучать эффективность различных лекарственных препаратов на течение хронической ишемии конечности II - III стадии, а недостатком – отсутствие возможности создать хроническую ишемию IV стадии.

В патогенезе язвенно-некротической стадии критической ишемии особенно у больных сахарным диабетом кроме обструкции артериального русла большое значение имеет компенсаторное замедление оттока крови по венам нижних конечностей с развитием ишемического отека и ишемической нейропатии. Из клинической практики хорошо известно, что трофические расстройства мягких тканей развиваются при декомпенсации артериального и венозного кровотока, нарушении иннервации конечности. Поэтому целесообразно при моделировании критической ишемии вызывать не только нарушение артериального притока, но и замедление венозного оттока и периферическую нейропатию конечности.

Цель исследования: разработка способа моделирования язвенно-некротической стадии критической ишемии нижних конечностей.

Материалы и методы.

Экспериментальное исследование выполнено на 120 крысах - самцах линии «Wistar», разделенных на 4 группы по 30 особей в каждой. Исследование выполнено в соответствии с правилами проведения экспериментальных исследований на животных (Страсбург, 1986).

В первой группе (интактной) определяли уровень микроциркуляции в мышцах задней конечности. Во второй группе (ложнооперированной) выполняли  разрез кожи вдоль бедра по внутренней поверхности с выделением сосудисто-нервного пучка бедра и ушивание раны непрерывным швом. В третей группе (сравнения) моделирование хронической ишемии мышц голени производили путем удаления бедренной, подколенной, передней и задней большеберцовых артерий. В четвертой группе (опытной) для моделирования хронической критической ишемии мышц голени удаляли бедренную, подколенную, переднюю и заднюю большеберцовые артерии и вены, повреждали периферический нерв.

В опытной группе животное погружалось в наркоз внутрибрюшинным введением хлоралгидрата 300 мг/кг массы. Разрез выполняли от паховой складки до стопы по внутренней поверхности конечности. Вначале выделяли на всем протяжении бедренную. подколенную и берцовые артерии. Все отходящие коллатеральные ветви пересекали и лигировали. Иссекали бедренную, подколенную и берцовые артерии. Аналогичным образом выделяли бедренную, подколенную и берцовые вены. Впадающие коллатерали пересекали и лигировали. Удаляли магистральные вены конечности. Обнажали седалищный нерв и проводили его пересечение [9].

В послеоперационном периоде проводили наблюдение за динамикой симптомов ишемии конечности. Животных выводили из эксперимента по 10 особей в каждой группе путем передозировки наркоза хлоралгидрата на 10-е, 21-е и 28-е сутки. Перед выведением на тех же сроках определяли уровень микроциркуляции при помощи лазерной допплеровской флоуметрии. Значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ).Подробная методика определения уровня перфузии тканей изложена в предшествующей работе [10].

Для изучения морфологической картины на тех же сроках в третьей и четвертой группах иссекали ишемизированную икроножную мышцу голени и проводили стандартное гистологическое исследование.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета Microsoft Excel 2010. Достоверность отличий между показателями групп оценивали по критерию Манна-Уитни и Пирсона. При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты исследования

В первой и второй группах клинических признаков ишемии конечности не было.

Сравнительная характеристика клинической картины ишемии конечности в третьей и четвертой группе представлена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика клинической картины хронической ишемии

Table 1. Characteristics of the clinical picture of chronic ischemia

Симптомы экспериментальной ишемии конечности Experimental symptoms limb ischemia	Группа 3 (сравнения) Group 3 (comparisons)		Группа 4 (опытная) Group 4 (experimental)
	n=30	%	n=30	%
Ограниченное участие конечности в передвижении Limited limb involvement in motion	27	90	30	100
«Перемежающаяся хромота» "Intermittent claudication"	26	86,6	30	100
Гиперемия кожи конечности Hyperemia of the limb skin	19	63,3	28	93,3*
Сухая гангрена пальцев, части стопы Dry gangrene of the toes, parts of the foot	2	6,6	21	70*
Ишемический некроз Ischemic necrosis	1	3,3	17	56,6*
Ишемический отек Ischemic edema	1	3,3	30	100*

* - p <0.05 по сравнению с третьей группой

* - p <0.05 compared to the third group

 

Сразу после проведения эксперимента у животных в третьей группе развивалась острая ишемия: конечность выключалась из передвижения, кожные покровы становились бледные и холодные. Через 3-5 суток в третьей группе острая ишемия переходила в хроническую. Животное начинало наступать на оперированную конечность, развивалась перемежающая хромота, исчезали бледность, а похолодание сменялось гиперемией кожных покровов. Трофические расстройства в виде ишемических некрозов, отека и гангрены пальцев стопы развивались лишь у 13,3%.

У животных в четвертой группе острая ишемия сопровождалась развитием отека стопы и голени и отсутствием болевой чувствительности на оперированной конечности. Через 3-5 суток у всех животных появлялись симптомы язвенно-некротической стадии критической ишемии: нарастающий отек конечности, ишемические некрозы, трофические язвы, сухая гангрена пальцев стопы.

Динамика перфузии мышц голени в группах экспериментальных животных представлена в таблице 2.

Таблица 2. Динамика перфузии в мышцах голени (M±m) в перфузионных единицах

Table 2. Dynamics of perfusion in the leg muscles (M ± m) in perfusion units

 

Группа животных Group of animals	10 сутки (n=10)	21 сутки (n=10)	28 сутки (n=10)
Интактная Intact	528,6±11,4	531,6±12,08	533,4±11
Ложнооперированная Falsely operated	521,4±11,46	523±13,79	524,1±15,1
Сравнения Comparisons	213,6±7,53*	320,9±3,7*	376,7±10,68*
Опытная Experienced	160,5±3,28*   **	249,1±7,31*   **	302,9±6,46*   **

 * - p>0,05 в сравнении с интактной и ложно оперированной группами животных; ** - p >0,05 при сопоставлении с группой сравнения

 

 * - p>0,05 in comparison with intact and sham-operated groups of animals; ** - p >0,05 when compared with a comparison group

 

В интактной группе отмечены незначительные колебания уровня перфузии. В группе ложнооперированных животных среднее значение уровня микроциркуляции в мышцах  голени на всех сроках не имело достоверных отличий от показателей в группе интактных животных. В группе сравнения перфузия ишемизированных мышц голени была достоверно ниже, чем в группе интактных и ложно оперированных  животных: на 10-е сутки - в 2,5 раза, на 21-е сутки - в 1,7 раза и на 28-е сутки - в 1,4 раза. В опытной группе перфузия ишемизированных тканей была достоверно ниже не только значений интактной и группы ложнооперированных животных но и группы сравнения: на 10-е сутки в 1,3 раза, на 21-е в 1,3 раза, на 28-е сутки в 1,2 раза.

Динамика площади некроза в икроножной мышце представлена в таблице 3.

Таблица 3. Динамика площади некроза (%)

Table 3. Dynamics of the area of necrosis (%)

Группы животных Animal groups	10 сутки	21 сутки	28 сутки
Сравнения Comparisons	27,5±6	11±2,5	8,5±1,5
Опытная Experienced	48,7±8*	19,2±4,1*	15,3±2,7*

* - p <0.05 при сопоставлении с группой сравнения

* - p <0.05 when compared with a comparison group

 

В опытной группе площадь некроза в ишемизированной икроножной мышце была больше, чем в группе сравнения  на 10-е сутки на 21,2%, на 21-есутки - на 8,2% и на 28-е сутки – на 6,8% (p<0,05).

Динамика морфологической картины в ишемизированной икроножной мышце голени у животных третьей группы была следующая. На 10-е сутки в участках некроза клетки воспалительного ряда нейтрофилы и лимфоциты преобладали над клетками гистиоцитарного ряда – макрофагами и фибробластами, что свидетельствовало о наличии тяжелого воспалительного процесса. На 21-е сутки начиналось замещение погибших мышечных волокон грануляционной тканью. Клетки гистиоцитарного ряда начинали преобладать над клетками воспалительного ряда. На 28-е сутки интенсивность репаративного процесса увеличивалась за счет регенерирующих миобластов, участки некроза замещались элементами соединительной ткани.

В опытной группе на всех сроках эксперимента некротические и воспалительные изменения были более выраженными. На 10 сутки очаги некроза были полностью инфильтрированы нейтрофилами и лимфоцитами, клеток репаративного ряда не обнаруживалось. На 21 сутки на фоне участков некроза, инфильтрированных клетками воспаления, начали появляться единичные клетки репативного ряда. На 28 сутки в участках некроза мышечной ткани  клетки воспалительного ряда преобладали над клетками репаративного ряда.

Заключение. Полученные результаты позволяют констатировать, что предлагаемая нами модель критической ишемии конечности у крыс является максимально приближенной к таковой у человека при язвенно-некротической стадии облитерирующих заболеваниях артерий нижних конечностей. Это позволяет рекомендовать данную модель к использованию, как наиболее перспективную для оценки возможных способов коррекции данной патологии.

Об авторах

Борис Семенович Суковатых

Курский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: SukovatykhBS@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-2197-8756

профессор, д.м.н., заведующий кафедрой общей хирургии Курского государственного медицинского университета

Россия, Курск, Российская Федерация

Эльвин Эйнулла оглы Фейзиев

Курский государственный медицинский университет

Email: elvin251546@gmail.com

соискатель кафедры общей хирургии

Россия, ул. К.Маркса, д3, Курск, 305041, Российская Федерация

Александр Сергеевич Белоус

Курский государственный университет

Email: a.s.belous@mail.ru

к.м.н., старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории «Генетика» Курского государственного университета

Россия, ул. Радищева, д.33, Курск, 305000 Российская Федерация

Елена Владимировна Трубникова

Курский государственный университет

Email: tr_e@list.ru

д.б.н., заведующая научно-исследовательской лабораторией «Генетика» Курского государственного университета

Россия, ул. Радищева, д.33, Курск, 305000 Российская Федерация

Михаил Борисович Суковатых

Курский государственный медицинский университет

Email: SukovatykhMB@kursksmu.net

к.м.н., доцент кафедры общей хирургии Курского государственного медицинского университета

Россия, ул. К.Маркса, д3, Курск, 305041, Российская Федерация

Анжелика Юрьевна Орлова

Курский государственный медицинский университет

Email: anzhelika_orlova@bk.ru

к.м.н., ассистент кафедры общей хирургии Курского государственного медицинского университета

Россия, ул. К.Маркса, д3, Курск, 305041, Российская Федерация

Список литературы

Дополнительные файлы