Моделирование инфицированной раны у крыс с длительно текущим сахарным диабетом

Полный текст

Несмотря на достижения медицины и эндокринологии   за последние десятилетия вопросы лечения и реабилитации больных с синдромом диабетической стопы до сих пор остаются одной из самых актуальных проблем гнойной хирургии. Число больных, страдающих сахарным диабетом неуклонно растет. Синдром диабетической стопы относится к одному из самых печальных осложнений длительно текущего сахарного диабета, так как в большинстве   случаев заканчивается ампутацией и инвалидизацией, наносящей значительный социально-экономический ущерб [1-5]. Синдром диабетической стопы выявляется у 80% пациентов с сахарным диабетом с длительностью заболевания более 20 лет и тенденции к снижению количества этих больных нет. Кроме того больные с СД, осложненным СДС в 25% случаев требуют стационарного лечения и по частоте возникновения занимают ведущее положение среди других осложнений сахарного диабета [2, 6, 7, 8]. Статистика Российского регистра, свидетельствует о том, что частота высоких ампутаций у больных СД осложненным СДС составляет от 0,76 до 18,2 на 1 тыс. больных, а в среднем по стране —она составляет   6,4 на 1 тыс. больных. Доля больших ампутаций, по данным статистики Российского регистра больных СД, среди этой категории больных   составляет 48,9–60,0%.

Сегодня в клиническую практику внедряют множество средств, способов и методик лечения гнойно-некротических поражений стоп при сахарном диабете, но, несмотря на множество используемых методов лечения, число высоких ампутаций и летальный исход у больных с этой патологией остается значимым, а проблема актуальной и до конца не решенной [4, 9, 2, 10].  

Изучение и оценка эффективности применения новых методов лечения гнойно-некротических осложнений у больных с СДС крайне необходима.

В последнее время в мировой лечебной практике все большее признание находят способы локальной местной озонотерапии. Озонированные растворы, используются для обработки ран и полостей организма, широкое применение нашли парентеральные методы использования озонированных растворов и различные способы использования озонированной аллокрови.  Современные научные исследования подтверждают безопасность этого метода лечения и его результативность [16]. Считается доказанным, что лечебный эффект озонотерапии наступает за счет физиологической активации свободнорадикальных реакций. По принципу обратной связи озон запускает и при необходимости активирует собственную антиоксидантную систему [10, 14, 15, 16].

На протяжении последних 10-20 лет ультразвуковое излучение широко используют в различных отраслях науки, техники, медицины [11, 12, 13]. Ультразвуковые волны обладает высокой механической энергией и запускают ряд как биологических, так и физических и химических процессов, что объясняет интерес к изучению механизма действия ультразвука на биологические объекты и приобретает высокий интерес изучения его эффективности при длительно текущих гнойных процессах. Но до настоящего времени нет достоверных данных по эффективности совместного использования местной озонотерапии и ультразвука на гнойную рану.

Цель исследования: смоделировать длительно текущий СД и инфицированную рану на фоне длительно текущего сахарного диабета.

Материалы и методы. В экспериментальное исследование включено 120 крыс популяции линии Wistar массой от 180,0 до 200,0 г возрастом 4 месяца. Эксперимент выполнен согласно требованиям, изложенным в директивах Европейского сообщества и Хельсинской декларации и одобрен биоэтической комиссией по работе с животными и Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России от 28 июня 2018 года, протокол заседания №2.

Крысы  по 40 животных  в каждой группе распределены в три серии эксперимента: первая группа – контрольная, здоровые животные;  вторая группа – крысы, которым натощак, после 24 часового голодания формировали аллоксан-ремаксол индуцированный сахарный диабет, который  вызывали интраперитонеальным введением 5% аллоксана в дозе 200 мг/кг (40 мг), через 15 минут интраперитониально  вводили гепатопротектор – ремаксол 13 мл/кг (2,5 мл), обладающий детоксикационным и мембранопротекторным  действием; вторая группа – крысы у  которых после 24 часового голодания вызывали  аллоксан индуцированный сахарный диабет , который  моделировали интраперитонеальным введением 5 % аллоксана в дозе 200 мг/кг (40 мг).

  Модель аллоксанового сахарного диабета относится к одной из самых распространенных и изученных. Аллоксан является структурным аналогом глюкозы, что позволяет ему накапливатся в B-клетках поджелудочной железы и приводит к гибели В-клеток с последующим развитием диабета. При этом поражению B-клеток способствуют дегенеративные изменения в паренхиме почек и гепатоцитах. Кроме того, при моделировании СД аллоксаном в организме животных развивается оксидативный стресс. Эти изменения необратимы и именно они по всей видимости приводят к высокой смертности лабораторных животных в первые сутки после введения аллоксана. Поэтому для моделирования длительно текущего диабета мы использовали препарат Ремаксол, обладающий гепатопротекторным и антиоксидантным действием. Ремаксол (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН», Санкт-Петербург) – один из самых эффективных препаратов в этой области. Ремаксол превращает анаэробные процессы в аэробные, нормализует энергетическую потребность гепатоцитов, ускоряет синтез макроэргов, предотвращает разрушение мембран клеток печени продуктами перекисного окисления липидов и восстанавливает активность ферментов антиоксидантной защиты. Ремаксол снижает цитолиз в печени и снижает активность аминотрансфераз и содержание билирубина, способствует улучшению экскреции прямого билирубина в желчь. Препарат уменьшает токсическое влияния холестаза на организм.

Результаты и обсуждение. Животные после моделирования СД содержались в одинаковой среде проживания и получали одинаковый питательный рацион. Животных без каких-либо вмешательств выдерживали в течение 93 дней.  В первой группе экспериментальных животных без сахарного диабета выжило 38 крыс, во   второй группе выжило 30 крыс, а в третьей – 23 крысы. У крыс первой группы не наблюдали достоверно статистически значимого снижения веса в течение всего срока эксперемента, у животных второй группы средние показатели массы тела статистически значимо не снижались, тем временем как у крыс третьей группы средний вес к концу третьего месяца наблюдения снизился в среднем на 40 % от исходного и был значительно ниже чем у животных первой и второй групп. У крыс второй группы через три месяца были полностью купированы клинические признаки токсических проявлений. Данный эффект объясним антиоксидантным и гепатопротективным действием ремаксола. Тем временем как у экспериментальных животных третьей группы на всем протяжение эксперимента   наблюдалась клиника токсических проявлений, которые, по всей видимости, и обусловили в дальнейшем высокую гибель животных в этой группе.

У всех животных ежедневно выполняли регистрацию уровня глюкозы крови глюкометром Ascensia Entrust фирмы Bayer. Утром натощак, у крыс второй и третьей группы забирали из хвостового сосуда   венозную кровь. Уровень глюкозы крови крыс второй группы в течение 3 месяцев составил 7,3±0,4 мкмоль/л, а у животных третьей группы -7,9±0,48 мкмоль/л. Сахар крови у животных второй и третьей группы на протяжении всего срока наблюдения был значимо выше по сравнению с животными контрольной группы (р˂0,05).  Стабильно высокий уровень сахаров в течение всего эксперимента, доказывает наличие СД у животных второй и третьей группы (таблица 1). Однако следует отметить, что у животных второй группы на фоне аллоксан-ремоксолового сахарного диабета, сахара были стабильно высокими, но в течении всего времени наблюдения не имели статически значимых повышений в отличии животных с аллоксан-смоделированным сахарным диабетом.

  Таблица 1. Содержание глюкозы в сыворотке крови крыс линии Wistar после моделирования сахарного диабета.

Table  1. The blood glucose content in the blood serum of Wistar rats after modeling diabetes mellitus.

Сутки	Контрольная группа (ср. глюкозы ммоль\л)	1 группа (ср. глюкозы ммоль\л)	2 группа (ср. глюкозы ммоль\л)
0	4,1±0,4	5,1± 0,8	3,9±1,1*
3	4,1±0,4	7,25 ±1,	8,06±1,2*
6	5,1±0,4	7,6±0,9	6,9±1,8
9	4,7±0,3	7,7±0,9	8,06±1,2*
12	4,9±0,5	7,2±0,9	9,45±1,2*
15	4,6±0,4	7,4±0,7	9,3±1,2*
30	4,68±0,6	6,9±0,4	8,06±1,04*
50	4,3±0,4	6,6±0,6	7,56±1,3
60	5,1±0,5	7,4±0,6	8,03±1,3*
70	4,8±0,5	6,3±0,7	7,2±0,9*
80	4,7±0,7	7,7±0,9	7,5±1,2
90	4,5±0,4	7,8±0,9	7,95±1,6
100	4,5±0,4	7,4±0,7	8,3±1,8*
110	4,6±0,2	7,6±0,7*	8,73±0,9*
120	4,8±0,4	7,9±0,8*	8,6±1,2*

Примечание: * - достоверность различий по сравнению с второй группой животных

Note: * - the significance of differences compared to the second group of animals

Таким образом, экспериментальные животные болели СД в течение 4 месяцев, что соответствует 6-8 годам человеческой жизни. Уровень сахара крови поддерживали добавлением в пищу животных углеводсодержащих продуктов.

Спустя 4 месяца от формирования сахарного диабета 30 крысам с аллоксан-ремаксол индуцированным сахарным диабетом и 5 здоровым крысам, смоделировали инфицированную рану.

В асептических условиях, под наркозом (с помощью препарата золетил 100 - 15 мг/кг в/м), животных фиксировали неподвижно, в межлопаточной области, иссекали кожу до поверхностной фасции в виде окружности, диаметром около 35-40 мм. Поперечными и продольными взаимоперпендикулярными разрезами в области дна раны рассекали поверхностную фасцию. По краям раны накладывали кисетный шов, для нарушения микроциркуляции, а затем кожу вокруг раны стягивали, уменьшая рану до 15-20 мм в диаметре.  Для формирования инфицированной раны использовали 3-х млрд. суточную культуру Staphylococcus aureus, штамм 209Р, которая характеризуется лецитиназной, гемолитической активностью и дает положительную дерматонекротическую пробу.

У всех животных инфицированная рана формировалась к седьмому дню эксперимента. Кожа вокруг раны была отечна, несколько гиперемирована. Рана была в виде глубокого дефекта кожи подковообразной формы с фибринозно-гнойным отделяемым.  Внешний вид раны представлен на рисунке 1.

    При гистологическом исследовании тканей раны эпителий отсутствовал, сосочковый слой кожи был разрушен, гиподерма отсутствовала (рис.2) 

При бактериологическом исследовании выявили смешанные популяции микробов, не отличающихся от микробного пейзажа трофических язв больных с СД II типа. Число микробных тел в ране превышало 10⁶ КОЕ, что соответствовало содержанию микробов на 1 г ткани в инфицированных ранах.

Заключение. Таким образом, СД, индуцированный аллоксан-ремаксолом позволяет смоделировать длительно текущий СД со стабильно высокими сахарами, что дает возможность для выполнения поставленных научных задач.

 

Об авторах

Анна Борисовна Куликова

ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России

Email: nyura.84@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3238-0346

доцент кафедры Общей хирургии имени профессора М.И. Гульмана

Россия, г.Красноярск , ул. Партизана -Железняка 1 , 660022

Людмила Викторовна Кочетова

ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России

Email: dissovetKrasGMU@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-5784-7067

к.м.н., профессор Кафедры общей хирургии имени профессора М.И. Гульмана

Россия, Российская Федерация, 660022, г.Красноярск, ул. Партизана Железняка, д.1

Елена Алексеевна Хапилина

ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: hapilina_elena@mail.ru

к.м.н., доцент кафедры Анатомии человека

Реюньон, Российская Федерация, 660022, г.Красноярск, ул. Партизана Железняка, д.1

Список литературы

Дополнительные файлы