Постгипоксические изменения трансформации стенки кишки потомства крыс

Полный текст

Введение

В течение многих десятилетий ведется активный поиск факторов риска, наличие которых напрямую коррелирует с формированием врожденных пороков развития и хирургических заболеваний периода новорожденности [1].

Доказано, что гипоксия является одним из ведущих предикторов развития многих патологических процессов, таких как различные формы атрезии кишечника, болезнь Гиршпрунга, некротизирующий энтероколит [2, 3].

В отечественной и зарубежной литературе представлено большое количество экспериментальных работ, которые с позиции доказательной медицины подтверждают тяжесть воздействия гипоксии на организм, как в антенатальном, так в постнатальном периодах.

Структурные изменения в сосудистом и нервно-регуляторном звеньях, являются приоритетными при формировании патологических процессов в желудочно-кишечном тракте [4-7].

Отмечено, что нервная система кишечника не полностью развита к моменту рождения и продолжает формирование нейронов на ранних постнатальных стадиях. Соотношение цитоплазматической области иммунореактивных центров головного мозга к площади мезентериальных ганглиев в кишечной трубке значительно снижено в группе пациентов с некротизирующим энтероколитом, в отличие от новорожденных с атрезией кишечника. Экспериментальная трансплантация нервных стволовых клеток с последующей их дифференцировкой в функциональные нейроны приводит к улучшению кишечного транзита [8].

При проведении окклюзии сосудов брыжеечной аркады дистального отдела подвздошной кишки маловесных доношенных поросят в течение 48 часов показало, что в морфологической картине присутствует широкий диапазон изменений: от минимальных в виде эрозий слизистой оболочки и десквамации единичных эпителиальных клеток, до выраженных с некрозом, изъязвлениями, пневматозом, перфорацией стенки кишки и развитием перитонита [9, 10].

Цель работы – изучить постгипоксическую трансформацию стенки кишечника на экспериментальной модели потомства крыс с помощью световой и электронной микроскопии.

Материалы и методы

Дизайн исследования

В экспериментальной работе использованы 24 самки белых беспородных крыс с массой 156—230г, в возрасте от 4 до 10 мес. Лабораторные животные были разделены на 4 группы, по 6 самок в каждой. Группе I проводили гипоксию в первом триместре беременности (1-я неделя), II – во втором триместре (2-я неделя), III – в третьем триместре (3-я неделя), IV – в течение всего антенатального периода (21 день). Параллельно проводимой гипоксии была отсажена группа V контрольная, в которой особи не подвергались кислородному голоданию.

Для моделирования хронической гипобарической гипоксии крыс помещали в вакуумную проточную барокамеру, в условия, соответствующие подъему на высоту 5000м со скоростью 25 м/сек.  на 40 мин. по группам, ежедневно в течение 7 дней.

После родоразрешения потомство осматривали, подвергали гексеналовому наркозу, затем cпомощью декапитации выводили из эксперимента.

Экспериментальное исследование проводили в соответствии с законодательством РФ («Правила гуманного обращения с лабораторными животными», «Деонтология медико-биологического эксперимент») и этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006г.) с разрешения Этического комитета НижГМА (протокол № 16, 2013г.).

Для световой микроскопии забирали резецированный участок тонкой, толстой кишки, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах и заливали в парафин. Приготовленные на микротоме Leica SM 2000 R срезы, толщиной 5 – 7 мкм, окрашивали гематоксилин-эозином – обзорная окраска.

Последующее микроскопирование осуществляли на микроскопах Topic (Бельгия, 2000) и Bio Blue (Нидерланды, 2013) с применением окуляра 10х, объективов 40х, 100х.

Проводили морфометрическое исследование всех структур кишечной стенки – количество ворсин на единицу периметра кишечной трубки, высоту эпителия, высоту ворсин, глубину крипт, толщину мышечной оболочки, а также площадь микроциркуляторного русла серозной оболочки. Изучали площадь сосудистого русла на единицу площади брыжейки, толщину стенок кровеносных сосудов артериальной системы брыжейки.

Электронно-микроскопический анализ образцов кишечника проводили по стандартной методике: фиксация в 2,5 % растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) с последующей дофиксацией 1% раствором четырёхокиси осмия и заливкой в смесь эпоксидных смол аралдита и эпона. Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Leica UC7 (Австрия). Срезы контрастировали спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдцу, затем анализировали в трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI, США).

Результаты и их обсуждение

Гистологическое исследование кишечника у крысят всех групп показало, что строение стенки кишки не отличается от контрольной группы, и представлено наличием четырех слоев – слизистого, подслизистого, мышечного и серозного.

В то же время изучение стенки выявило достоверное снижение толщины слизистой и утолщение мышечной оболочек (рис.1).

 

 

Рис. 1. Слизистая оболочка новорожденного крысенка I группы исследований. Истончение слизистой оболочки (указано стрелкой) (гематоксилин-эозин, ув.- об.40х, ок.15х)

Fig. 1. The mucous membrane of a newborn rat of the first group of studies. Thinning of the mucous membrane (indicated by an arrow) (hematoxylin-eosin, uv. - vol. 40x, approx. 15x)

 

  Хроническая гипоксия, смоделированная в первый триместр беременности, привела к развитию вторичной тканевой гипоксии в стенке кишки, результатом чего явилось уменьшение эпителиального компонента, проявляющееся снижением толщины слизистой оболочки и разрастанием соединительной ткани в мышечном слое (рис. 2). Увеличение соединительной ткани вместо гладких мышечных волокон, как правило, приводит к нарушению сократительной способности стенки и развитию динамической непроходимости.

 

Рис. 2. Стенка кишки новорожденного крысенка I группы при хронической гипоксии. Утолщение мышечного слоя (указан стрелкой) (гематоксилин-эозин, ув.- об.40х, ок.10х)

Fig. 2. The intestinal wall of a newborn rat of group I in chronic hypoxia. Thickening of the muscle layer (indicated by the arrow) (hematoxylin-eosin, uv. - vol. 40x, approx. 10x)

 

Электронно-микроскопическое исследование ткани кишки показало, что в слизистой оболочке среди столбчатых эпителиоцитов, бокаловидных клеток и эндокриноцитов встречали интерэпителиальные лимфоциты. В эпителиоцитах выявили митотическую активность (рис. 3а), в то же время обнаружены миелиноподобные структуры (рис. 3б). В бокаловидных клетках найден гипертрофированный комплекс Гольджи (рис. 3б).

В собственной пластинке слизистой оболочки в фибробластах наблюдали просветление цитоплазмы, гомогенизацию плазмалеммы, визуальное уменьшение количества рибосом, расширение цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума, просветление матрикса митохондрий и деструкцию крист. В подслизистой основе отмечены макрофаги, единичные эритроциты, эозинофилы, лимфоциты. Обнаружены соединительнотканные клетки в состоянии митоза, нервные волокна с признаками нарушения ультраструктуры. Так, в шванновской клетке найдены вакуолизированные митохондрии, осевые цилиндры с электронно-прозрачной цитоплазмой (рис. 3в).

Микроциркуляторное русло было представлено гемокапиллярами, содержащими плазму. Часть сосудов включала зрелые и молодые формы эритроцитов (рис. 3г). В базальной мембране сосудов были гомогенизированные локусы или участки разволокнения. В эндотелии имелись многочисленные везикулы, митохондрии с просветлением матрикса. Количественный анализ показал в 36% гемокапилляров наблюдали нарушение ультраструктуры в виде набухания или истончения эндотелиальной выстилки, вакуолизацию, мембранные структуры в просвете, приводящие к нарушениям микроциркуляции.

 

а	б
в	г
Рис. 3. Ультраструктура стенки нисходящего отдела толстой кишки потомства крысы (пренатальная гипоксия группы 1). а – митоз эпителиоцитов (стрелка), х 4500; б - миелиноподобные структуры в эпителиоците (стрелка), х 11000; в – шванновская клетка с вакуолизированными митохондриями (стрелка), х 8900; г – гемокапилляр, х 5600

Fig.3. Ultrastructure of the wall of the descending colon of the rat offspring (prenatal hypoxia of group 1). a-mitosis of epithelial cells (arrow), x 4500; b-myelin-like structures in the epithelial cell (arrow), x 11000; в-Schwann cell with vacuolated mitochondria (arrow), x 8900; г – hemocapillary, x 5600

 

Гипоксия, сформированная во втором и третьем периодах беременности, не приводила к столь существенному увеличению фиброзной ткани в стенке кишки, однако в материале отмечено вовлечение эпителиального компонента в патологический процесс. Так, гипоксия второго периода беременности сопровождалась атрофией слизистой оболочки преимущественно за счет укорочения   и уменьшения количества ворсин (рис. 4).

1

Рис. 4. Стенка кишки новорожденного крысенка группы II. Укорочение ворсин (1) и уменьшение их количества (гематоксилин-эозин, ув.- об.10х, ок.10х)

Fig. 4. The intestinal wall of a newborn rat of group II. Shortening of the villi (1) and reducing their number (hematoxylin-eosin, uv. - vol. 10x, approx. 10x)

 

 

Покровный эпителий оставался призматическим, хотя и уплощенным, с участками атрофии, нарастанием числа бокаловидных клеток с апокриновым типом секреции, заполненных вакуолизированной цитоплазмой, тогда как у животных контрольной группы последний имел четкий ровный контур, а цитоплазма клеток  выглядела однородно эозинпозитивно (рис. 5).

 

Рис. 5. Ворсины кишки животных III группы исследования. Вакуолизация эпителиальных клеток (гематоксилин-эозин, ув.- об.40х, ок.15х)

Fig. 5. Intestinal villi of animals of group III of the study. Vacuolation of epithelial cells (hematoxylin-eosin, uv. - vol. 40x, approx. 15x)

 

Электронно-микроскопическое исследование стенки кишечника потомства крыс группы II выявило сходную морфологическую картину с животными группы I. Отмечено, что в эпителиальном слое представлено значительное количество бокаловидных клеток, обнаружены столбчатые эпителиоциты в состоянии деления, эндокриноциты. Также были  увеличены межклеточные пространства в базальной части клеток, в то время как в апикальной - плотные контакты сохранены. В собственной пластинке слизистой и в подслизистой основе выявлен отек интерстициальной ткани и набухание отдельных фибробластов (рис. 6а). В межклеточном пространстве обнаружены нейтрофилы.

В микроциркуляторном русле наблюдали плазматические капилляры (рис. 6б). В сосудах, содержащих форменные элементы крови выявлены зрелые и молодые эритроциты, тромбоциты, нейтрофилы. В эндотелии капилляров констатировали пиноцитозные пузырьки (рис.6б), в митохондриях - трансформированные кристы и частичное вымывание матрикса. Базальная мембрана была разволокненной на большем протяжении. Количественный анализ показал, что в 33% сосудов наблюдали нарушение ультраструктуры.

 

а	б
Рис. 6. Ультраструктура стенки нисходящего отдела толстой кишки потомства крысы (пренатальная гипоксия группы II): а – фибробласты с набуханием гиалоплазмы, х 8900; б – гемокапилляр, х 11000

Fig.6. Ultrastructure of the descending colon wall of rat offspring (prenatal hypoxia of group II): a-fibroblasts with hyaloplasma swelling, x 8900; b-hemocapillary, x 11000

 

Хроническая гипоксия, смоделированная в третьем периоде беременности (группа III), сопровождалась снижением толщины слизистой оболочки. Однако изменение толщины стенки кишки у животных связывали с эффектом слущивания покровно-ямочного эпителия и формированием «голых» ворсин (рис. 7, 8). Среди которых отмечали много  утолщенных «стволовидных» форм с уплощенной поверхностью (рисунок 9).  

     

 

 

Рис. 7. Покровный эпителий ворсин кишки животных контрольной группы (гематоксилин-эозин, ув.- об.40х, ок.15х)

Fig. 7. Epithelium of the intestinal villi of animals of the control group (hematoxylin-eosin, uv. - vol. 40x, approx. 15x)

 

 

Рис. 8. Стенка кишки животных группы III. Слущивание эпителия ворсин (гематоксилин-эозин, ув.- об.20х, ок.15х)

Fig. 8. Gut wall of group III animals. Exfoliation of the epithelium of the villi (hematoxylin-eosin, uv. - vol. 20x, approx. 15x)

 

               

Рис. 9. Кишечная ворсина животного группы III, утолщение и укорочение ворсин (указаны стрелками) (гематоксилин-эозин, ув.- об.40х, ок.15х)

Fig. 9. Intestinal villi of group III animal, thickening and shortening of villi (indicated by arrows) (hematoxylin-eosin, uv. - vol. 40x, approx. 15x)

    

 Электронно-микроскопическое исследование стенки кишки животных группы III показало, что в тканях выявлены как адаптивные, так и деструктивные процессы. 

Нарушения ультраструктуры в 50% сосудов выявлены в виде наличия мембранных структур в просвете, истончения эндотелиального слоя, вакуолизации митохондрий, что способствовало нарушению проницаемости и перикапиллярному отёку. В отдельных сосудах была агрегация эритроцитов (рис.10а, б).

 

а

б

Рис. 10. Ультраструктура стенки нисходящего отдела толстой кишки потомства крысы (пренатальная гипоксия III триместр): а – перикапиллярный отек (стрелка), х11000; б – агрегация эритроцитов в гемокапилляре (стрелка), х5600 Fig. 10. Ultrastructure of the descending colon wall of rat offspring (prenatal hypoxia of the third trimester): a-pericapillary edema (arrow), x11000; b – aggregation of red blood cells in the hemocapillary (arrow), x5600

 

Изменение соотношения между слоями стенки кишки приводило к сужению просвета последней, из-за фиброза средней оболочки, что констатировано у животных первой группы. У потомства второй и третьей групп расширение просвета способствовало нарушению динамических свойств кишечной трубки и развитию ее дисфункции (рис. 11).

 

1

       

Рис. 11. Просвет кишки животных I группы. Сужение просвета кишки (1) (гематоксилин-эозин, ув.- об.20х, ок.10х)

Fig.11. Lumen of the intestine of group I animals. Narrowing of the intestinal lumen (1) (hematoxylin-eosin, uv. - vol. 20x, approx. 10x)

 

Для оценки адекватности кровоснабжения кишки провели морфометрическое исследование площади артериального и венозного фрагментов кровеносного русла, а также толщины стенки артерий и вен (таблица).

 

Таблица/ Table

Характеристика структуры микроциркуляторного русла кишечника

Characteristics of the structure of the intestinal microcirculatory bed

Показатели/ Indicators	Контрольная группа (n = 14) / Control group (n = 14)	Группа I (n = 14)/ Group I (n = 14)	Группа II (n =28)/ Group II (n = 28)	Группа III (n = 19)/ Group III (n = 19)
Площадь 50-и артериальных сосудов брыжейки (мкм²)/Area of 50-and arterial vessels of the mesentery (mкm2)	305,59±18,44	520,97±26,84*	420,73±22,94*	265,25±15,92*
Толщина стенки артериолы (мкм)/Arteriole wall thickness (microns)	3,58±0,23	6,02±0,32*	3,80±0,33	3,78±0,23
Площадь 50-и капилляров серозной оболочки кишки (мкм²)/The area of 50 capillaries of the serous lining of the intestine (mкm2)	156,39±19,60	344,84±37,07*	424,46±21,33*	465,89±24,54*

Достоверность различий приведена в сравнении с контрольной группой.

* - р ˂ 0,001 / Reliability of differences is given in comparison with the control group    

 * - р ˂ 0,001

 

Характеристика микроциркуляторного русла указывала, что хроническая гипоксия, смоделированная в первый период беременности, приводит к компенсаторному расширению артериального локуса у плода с последующим развитием хронического венозного полнокровия, при этом площадь венозной части увеличивается вдвое. Гипоксия, созданная в поздние сроки беременности, не приводит к развитию компенсаторных процессов артериального русла и сопровождается венозным застоем с увеличением площади сосудов в три раза. Данное состояние усиливает гипоксию в стенке кишки, на фоне которой развиваются атрофические и дистрофические изменения эпителия слизистой оболочки.

 

Заключение

Таким образом, хроническая гипоксия, смоделированная в первый триместр беременности, приводит к значительным изменениям слизистой оболочки кишки в сочетании с разрастанием соединительнотканного компонента в мышечном слое. Риск развития динамической кишечной непроходимости возникает у потомства всех групп, что подтверждается увеличением фиброзной ткани в стенке кишки.

Экспериментально доказано, что выраженные изменения со стороны микроциркуляторного русла выявлены в группах II и III, так как отмечается предрасположенность к развитию предъязвенных и язвенных дефектов в стенке тонкой кишки.

На субмикроскопическом уровне показано, что во всех экспериментальных группах в ультраструктуре стенки кишечника потомства крыс после гипоксического воздействия в пренатальном периоде, происходят адаптивные и деструктивные процессы. В микроциркуляторном русле выявлено нарастание венозного застоя, причем наиболее выраженные изменения констатированы у потомства III группы.

Об авторах

Ирина Юрьевна Карпова

Приволжский исследовательский медицинский университет

Email: ikarpova73@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4897-6702

доктор медицинских наук, доцент, профессор, кафедры детской хирургии

Россия, Нижний Новгород, Российская Федерация

Марина Леонидовна Бугрова

Приволжский исследовательский медицинский университет

Email: marysmir@mail.ru

д.б.н., доц., профессор кафедры гистологии с цитологией и эмбриологией Приволжского исследовательского медицинского университета (основное место работы), зав. отделом электронной микроскопии ЦНИЛ (совмещение)

Россия, Нижний Новгород, пл.Минина и Пожарского, 10/1

Татьяна Ивановна Васягина

Приволжский исследовательский медицинский университет

Email: marysmir@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник отдела электронной микроскопии ЦНИЛ Приволжского исследовательского медицинского университета

Россия, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005, Российская Федерация

Дарья Васильевна Карпеева

Приволжский исследовательский медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: dashenka8723@mail.ru

ассистент кафедры детской хирургии Приволжского исследовательского медицинского университета

Россия, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005, Российская Федерация

Список литературы

Дополнительные файлы