Изучение морфологической трансформации и особенностей сосудистого кровотока стенки тонкой и толстой кишки при моделировании ишемии в эксперименте

Полный текст

Актуальность

Первые упоминания о мезентериальной ишемии относятся к 1507 году, опубликованные в труде итальянского анатома А. Бьенвени «О некоторых оккультных и необычных причинах болезней и их лечении» [1].

Острые нарушения мезентериального кровообращения (ОНМК), приводящие к инфаркту кишечника, встречаются у 0,2% больных хирургического профиля. Несмотря на развитие медицины, летальность при этом заболевании остается крайне высокой, достигая 67—92% [2, 3, 4].

Ишемия органов пищеварения развивается вследствие многообразных

этиологических факторов и может быть обусловлена как окклюзионно-стенотическим (окклюзивным) поражением висцеральных сосудов, так и неокклюзивными расстройствами абдоминального кровоснабжения, обусловленными снижением висцерального кровотока на микроциркуляторном уровне [5, 6, 7, 8].

Окклюзионный вид ОНМК в свою очередь подразделяется на тромботический тип (около 25%), развивающийся в результате острого артериального тромбоза проксимального сегмента сосуда (чаще всего устья верхней брыжеечной артерии), и эмболический тип (около 50% всех ОНМК), развивающийся в результате окклюзии, вызванной смещением с током крови эмболов, первоначально формирующихся проксимально (на фоне мерцания предсердий, пристеночного тромбоза левого желудочка после инфаркта, аневризмы сердца, аорты).

Неокклюзионное нарушение мезентериального кровообращения (НОНМК) составляет порядка 20% всех случаев инфаркта кишечника. В его патогенезе основную роль играют низкий сердечный выброс, гиповолемия, гемоконцентрация, уменьшение кровотока в системе брыжеечных сосудов. Эти факторы чаще всего имеют место при пролонгировании критических состояний в условиях реанимационного отделения, но могут встречаться у больных с отягощенным анамнезом, например: с сердечно-сосудистыми, гематологическими заболеваниями [2, 4, 9, 10].

Частота возникновения абдоминального ишемического синдрома достаточно высока: выявляется в 75,5% случаев при аутопсии умерших от ишемической болезни сердца, вследствие атеросклероза церебральных артерий и/или сосудов нижних конечностей, также выявляют атеросклероз брюшной аорты и ее непарных висцеральных ветвей [11, 12].

Встречаемость стенозирующих поражений висцеральных ветвей брюшной аорты по данным аутопсии варьирует от 19,2% до 70%, по данным ангиографии – от 4,1% до 53,5%. [13, 14].

Особенности кровоснабжения кишечника таковы, что наиболее уязвимыми местами является селезеночный угол и левый изгиб сигмовидной кишки, расположенные в зоне слабо развитых анастомозов верхней и нижней брыжеечных артерий. Ишемическое поражение прямой кишки в связи с эффективностью кровоснабжения встречается очень редко [15].

Цель исследования: представить в эксперименте воздействие разных степеней окклюзионной ишемии на морфологическую трансформацию кишечной стенки и уровень изменений кровотока.

Материалы и методы

На базе отделения экспериментальной медицины с виварием Приволжского исследовательского медицинского университета проведено изучение разных степеней ишемии тонкой и толстой кишки на 45 половозрелых крысах самцах линии Wistar весом 150–200г, полученных из филиала «Андреевка» Федерального Государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий».

Всех животных содержали в стандартных условиях вивария в клетках при свободном доступе к пище и воде. Условия работы соответствовали принципам биологической этики, требованиям «Международной Хельсинской конвенции о гуманном отношении к животным» (1972), правилам Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях ET/S 129 (Страсбург, 18 марта 1986) и приказу Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Протокол заседания Комитета по Этике ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России № 7 от 07.04.2021 г.

Моделирование ишемии проводили под общей анестезией (внутримышечно раствор Золетила 100, (60 мг/кг) в сочетании с раствором Ксила, 6 мг/кг). Наркотизированным животным выполняли срединную лапаротомию с последующей дифференцировкой отделов кишечники, в тонкой был выбран тощий отдел, в толстой – восходящий.  С помощью капроновой нити (5-0) проводили перевязку кровоснабжающих аркад указанных зон, с дальнейшей экспозицией на 40, 60 и 120 мин. Для сравнения результатов была сформирована контрольная группа из животных, которым ишемию не проводили (n=15).

По истечении времени обескровливания участков с помощью лазерного анализатора капиллярного кровотока (ЛАКК-02, «НПП Лазма», Россия) оценивали среднюю скорость кровоснабжения в капиллярных микрососудах, расположенных на глубине 0,5-1,0 мм, на площади 1,0 мм² в относительных единицах (Рисунок 1).

 

Рис.1. ЛАКК-02, «НПП Лазма» (Россия) с компьютерным обеспечением

Fig. 1. LAKK-02, NPP Lazma (Russia) with computer software

Принцип работы прибора основан на отражении зондирующего гелий-неонового лазерного пучка от движущихся эритроцитов. Показатель микроциркуляции (ПМ) зависит от количества эритроцитов в микрососудах, скорости их передвижения. Изменение частоты сигнала (эффект Доплера) связано с наличием плазматических промежутков между эритроцитами. Установка состоит из блока с цифровым индикатором и регистратором ПМ, лазерным пучком на кончике зонда, который устанавливали над исследуемым участком кишки. Животное находилось под наркозом, поскольку исследование проводили в процессе операции. Регистрацию выполняли перед перевязкой кишки и формированием патологического процесса спустя 40, 60, 120 мин.

После завершения оценки сосудистого кровотока, производили забор ишемизированных участков кишечника для морфологического изучения.

Экспериментальный материал фиксировали в 10% формалине, после чего препараты отправляли в стандартную гистологическую проводку на аппарате «Excelsior ES» (Thermo Scientific), погружали их в парафиновые блоки с использованием заливочной станции «HistoStar» (Thermo Scientific), окраска гематоксилином и эозином. Для морфометрической обработки и создания видеоархива полученного материала использовали микроскоп Leica 2500, объектив ×4, ×10, ×20, ×40, окуляр ×10 на базе отдела морфологии НИИТО ПИМУ.

Данные настоящего исследования обрабатывали с помощью приложения Excel и статистического пакета STADIA.

В таблицах «Описательная статистика» представлены базовые числовые характеристики изучаемых выборок: среднее, средне-квадратическое отклонение σ, ошибка выборочного среднего m, медиана, межквартильный размах и информация о распределении выборки (N – распределение практически нормальное, ≠N – распределение отлично от нормального). Для расчетов использовали приложение Excel и пакет STADIA.

Для анализа распределений выборок на предмет близости к нормальному рекомендованы следующие методы: метод анализа А и Е (асимметрии и эксцесса), метод Колмогорова, метод ω2 (омега квадрат), метод χ2 (метод Пирсона) – из пакета STADIA.

Подавляющее большинство выборок имели распределение, отличное от нормального, поэтому на этапе сравнения данных был применен парный непараметрический метод Вилкоксона, который изучает выборки по медианам.

В таблицах указаны сравниваемые выборки, результат различия (есть/нет), уровень значимости р, при котором проверялась Но-гипотеза, а также название числовой характеристики, с помощью которой проверялась Но-гипотеза (Но: нет различия в медианах).

 

Результаты и их обсуждение

В рамках экспериментального моделирования животных разделили на 4 группы: группа I – контрольная, в которой ткани не подвергали ишемии; группа II – ишемия 40 мин.; группа III – ишемия 60 мин.; группа IV – ишемия 120 мин. (Рисунок 2).

Рис.2. Изучение показателя микроциркуляции кишечника крыс при моделировании ишемии с помощью ЛАКК-02

Fig. 2. Study of the indicator of intestinal microcirculation in rats when modeling ischemia using LACC-02

Средняя скорость кровоснабжения в капиллярных микрососудах тонкой (18,95±2,37) и толстой кишки (18,77±3,33) животных группы I была идентичной при р˂0,05.

Локальное нарушение трофики через 40 мин. (группа II) выраженно дезорганизовало кровоток в стенке тонкой кишки (11,7±2,8), в толстой ПК составил 13,2±2,2, р˂0,05.

Патологические изменения в структуре сосудистого русла в группе III (через 60 мин.) продемонстрировало работу адаптационных механизмов, которые в тонкой кишке увеличили ПК на 1,98, а в толстой данный показатель превысил значения нормального кровоснабжения на 1,53.

Ишемия в течение 120 мин. констатировала дальнейший рост показателя кровотока в тонкой кишке до 17,3±3,1 и снижение ПК с 20,3±3,2 до 15,3±4,6 в толстой (таблицы 1-4).

 

Таблица №1 Описательная статистика для показателя кровотока тонкой кишки

 

Таблица №2 Таблица сравнения (тонкая кишка, выборки парные)

 

 

 

 

 

 

 

Таблица №3 Описательная статистика для показателя кровотока толстой кишки

 

Таблица №4 Таблица сравнения (толстая кишка, выборки парные)

 

 При анализе гистологических срезов кишечника, неизмененная слизистая оболочка (СО) тонкой кишки крыс напоминала СО человека и характеризовалась наличием высоких пальцевидных ворсинок, покрытых столбчатыми каемчатыми эпителиоцитами с распознаваемыми на светооптическом уровне границами. Ядра последних располагались базально, бокаловидные клетки хорошо определяли, как в ворсинках, так и в криптах.

Криптальный слой был выражен, в неизмененной слизистой оболочке тонкой кишки на одну ворсинку приходилось до 14±2,3 крипт. В основании их локализовались многочисленные клетки Панета (Рисунок 3, 4).

 

Рис.3. Высокие пальцевидные ворсинки и крипты СО тонкой кишки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х4

Fig. 3. High finger-like villi and crypts FROM the small intestine. Stained with hematoxylin and eosin. Oc.10x4

 

Рис.4. Многочисленные клетки Панета в СО тонкой кишки (указаны стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х10

Fig. 4. Numerous Paneta cells in the small intestine (indicated by arrows). Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x10

Необходимо отметить, что к базальной пластинке эпителия ворсин тесно прилегали капилляры, обеспечивающие обменные процессы в эпителиальном пласте. Как известно, эпителиальная ткань не имеет сосудов, и жизнеобеспечение ее идет за счет микроциркуляторной системы соединительной ткани. Установлено, что на 1000 эпителиоцитов в условиях адаптационной нормы приходилось до 108±6,7 прилегающих к базальной пластинке капилляров. Микроциркуляторное русло преимущественно было без явлений вазоэктазий и стаза, ядра эндотелиоцитов интактные, стенка сосудов тонкая и четко контурирует.

В слизистой оболочке группы контроля толстой кишки крысы определяли цилиндрический покровный эпителий с базально-расположенными овальными ядрами и границами клеток на всем протяжении эпителиального пласта.

При окраске гематоксилином и эозином базальная пластинка (БП) контурировала. Крипты представлены тесно расположенными трубчатыми структурами, пересекающими собственную пластинку от покровного эпителия до мышечной пластинки. БП крипт была тесно окружена прилегающими к ней перикриптальными фибробластами, микроциркуляторное русло без явлений вазоэктазий и стаза. В строме неизмененной слизистой оболочки толстой кишки всегда присутствовало небольшое количество клеток-иммигрантов, к которым относятся лимфоциты, плазматические клетки разной степени зрелости, эозинофильные и нейтрофильные гранулоциты.

В 50% исследований в биоптатах слизистой оболочки толстой кишки присутствовали лимфоидные узелки разной степени зрелости.

Степень капилляризации собственной пластинки слизистой оболочки толстой кишки в условиях адаптационной нормы – контроля составила 336±36,2 сосудов на 1 кв.мм.

При морфологической трансформации стенки тонкой кишечника животных группы II отмечали, что: на СО выявлены обильные наложения клеточного детрита и некротических масс; ворсинки СО укорочены и расширены, а эпителий ворсин с признаками дистрофии и стертыми границами клеток; подэпителиальный отек; сокращение количества прилегающих к базальной пластинки сосудов, вазоэктазии и явления капилляростаза; разрыхленность и утолщение стенки сосудов, набухшие ядра эндотелиоцитов; снижение числа сосудов в собственной пластинке СО;  в мышечной пластинке участки некроза, признаки лизиса мышечных волокон. На фоне представленных изменений констатировано, что число бокаловидных и клеток Панета сохранено (Рисунок 5, 6).

В толстой кишке выявлено отсутствие признаков воспаления и деформации, в микроциркуляторном русле небольшое число расширенных сосудов.

Рис. 5. Общий вид СО тонкой кишки с укороченными и расширенными ворсинками. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х10

Fig. 5. General view from the small intestine with shortened and expanded villi. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x10

 

Рис.6.  Обильные некротические наложения на поверхности СО тонкой кишки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х4

Fig. 6. Abundant necrotic overlays on the surface of the small intestine. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x4

При моделировании ишемии в течение 60 минут в тонкой кишке экспериментальных животных диагностировано: резкое укорочение и расширение ворсинок СО с дистрофическими изменениями (рельеф сглажен); разрыхление базальной мембраны, снижение бокаловидных клеток в ворсинах и отсутствие клеток Панета. В собственной пластинке СО отмечали выраженную диффузную лимфоплазмоцитарную инфильтрацию с присутствием полиморфно-ядерные лейкоцитов (ПЯЛ). В микроциркуляторном русле выявили полнокровие сосудов, расширенные сосуды с эритроцитарным стазом, регистрировали уменьшение толщины слизистой оболочки и гипертрофия мышечной пластинки.

В стенке толстой кишки, так же определяли полнокровные, расширенные кровеносные и лимфатичекие сосуды. На СО выявляли эритроцитарные массы, слабо выраженную лимфоплазмоцитарную инфильтрацию, участки кровоизлияний. Однако при данной длительности воздействия, СО толстой кишки имела обычное гистологическое строение с наличием регулярно расположенных крипт правильной формы (Рисунок 7 – 12).

 

Рис. 7. Сглаженный рельеф СО тонкой кишки крысы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х4

Fig. 7. Smoothed relief from the small intestine of a rat. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x4

 

А                                                                В

Рис. 8. Полнокровные сосуды микроциркуляции в строме ворсинок СО тонкой (А) и толстой (В) кишки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х10

Fig. 8. Full-blooded microcirculation vessels in the stroma of villi from the small (A) and large (B) intestines. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x10

 

Рис. 9. Паралитически расширенные полнокровные сосуды СО тонкой кишки крысы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х4

Fig. 9. Paralytically dilated full-blood vessels from the rat small intestine. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x4

Рис. 10.  Полнокровные сосуды микроциркуляции в области крипт СП СО. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х40

Fig. 10. Full-blooded microcirculation vessels in the crypt area of the joint venture. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x40

Рис. 11.  Резко сниженная толщина СО тонкой кишки и утолщенная мышечная пластика с расширенными сосудами. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х4

Fig. 11. Sharply reduced thickness of the small intestine and thickened muscle plastic with dilated vessels. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x4

Рис. 12.   Расширенные полнокровные сосуды микроциркуляции в межкриптальном пространстве тонкой кишки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х40

Fig. 12. Expanded full-blooded microcirculation vessels in the intercriptal space of the small intestine. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x40

            Воздействие 120 минут ишемии на стенку кишки иллюстрировало адаптационно-регенеративные особенности отделов кишечника: в биоптатах тонкой кишки деформированных ворсин не регистрировали, тогда как резецированные локусы толстой кишки имели укороченные, расширенные ворсинки с повышенной клеточной плотностью инфильтрата. Так же, в обоих отделах кишечника встречали множество расширенных тонкостеннных сосудов с выраженным эритроцитарным стазом, явления полнокровия сосудов, на поверхности СО обширные кровоизлияния, вазоэктазии с эритроцитарным стазом (Рисунок 13 – 15).

Рис. 13.  Наличием обширных участков кровоизлияний в СО тонкой кишки и жировой клетчатке крысы  при ишемии 120 мин. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х4

Fig. 13. The presence of extensive areas of hemorrhage in the small intestine and adipose tissue of a rat with ischemia 120 min. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x4                   

                                                                  

Рис.14. Расширенные ворсинки с наличием обширных участков кровоизлияний, множественных тонкостеннных сосудов с выраженным эритроцитарным стазом в строме большинства ворсин.  Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х10

Fig. 14. Dilated villi with the presence of extensive hemorrhage sites, multiple thin-walled vessels with pronounced erythrocyte stasis in the stroma of most villi. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x10

Рис. 15. Эритроцитарные стазы в сосудах МЦР в строме ворсин. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х40

Fig. 15. Erythrocyte stasis in the vessels of the MCR in the stroma of the villi. Stained with hematoxylin and eosin. Ос.10x40

Заключение

Таким образом, результаты представленного эксперимента позволяют отметить четкую взаимосвязь между показателями кровотока в разных отделах кишечника и длительностью ишемии. На фоне локального нарушения трофики возникают трансформации в гистоархитектонике стенки кишки. При воздействии ишемии в течение 40 – 60 мин., происходят выраженные изменения в слизистой оболочке за счет деструктуризации ворсин, расширения сосудов, нарастания явлений стаза, полнокровия, вазоэктазий и кровоизлияний, коррелирующие с низкими значениями показателя кровотока.   В период с 60 – 120 мин. ишемии активно включаются адаптационно-регенеративные механизмы способствующие максимально сократить стресс тканей при нарушении кровоснабжения за счет компенсаторных возможностей функционирующих аркад, расположенных рядом с ишемизированной зоной. В связи с чем, в тонкой кишке локальное адаптационное кровоснабжение способствует восстановлению системы «ворсина-крипта» слизистой оболочки на 120 мин., что позволят сохранить жизнеспособность и функциональность кишечной стенки.

 

Дополнительная информация

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных

конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Прозрачность исследования

Исследование не имело спонсорской поддержки. Исследователи несут полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.

Декларация о финансовых и иных действиях

Все авторы принимали участие в разработке концепции и дизайна исследования и в написании рукописи. Окончательная версия рукописи была одобрена всеми авторами. Авторы не получали гонорар за исследование.

 

 

Об авторах

Ирина Юрьевна Карпова

Приволжский исследовательский медицинский университет

Email: ikarpova73@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4897-6702
SPIN-код: 8464-8485

доктор медицинских наук, доцент, профессор, кафедры детской хирургии

Россия, 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского. д.10/1

Петр Владимирович Перетягин

Приволжский исследовательский медицинский университет

Email: peretyaginpv@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0707-892X
SPIN-код: 9241-1854

младший научный сотрудник отдела физико-химических исследований ЦНИЛ

Россия, 603005, Нижний Новгород, пл. Минина, 10/5

Наталья Юрьевна Орлинская

Приволжский исследовательский медицинский университет

Email: orlinskaya@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-2896-2968
SPIN-код: 3540-4182
Scopus Author ID: 33156677

профессор, зав. кафедрой патологической анатомии

Россия, 603005, Нижний Новгород, пл Минина 10/1

Наталья Юрьевна Широкова

Приволжский исследовательский медицинский университет

Email: nush63@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6242-5958

старший научный сотрудник, группа патологической анатомии

Россия, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005, Российская Федерация

Евгения Дмитриевна Пятова

Приволжский исследовательский медицинский университет

Email: edpyatova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7501-363X
SPIN-код: 2763-9209

старший преподаватель кафедры медицинской физики и информатики

 

Россия, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005, Российская Федерация

София Сергеевна Птушко

Приволжский исследовательский медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: ptushkosofia@email.com
ORCID iD: 0000-0002-1278-9497

Студентка 5 курса лечебного факультета

Россия, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005, Российская Федерация

Список литературы

Дополнительные файлы