Опыт моделирования трофической гнойной раны в эксперименте

Полный текст

Обоснование

Лечение гнойных ран остается одним из самых обсуждаемых вопросов хирургии [3; 13]. Доля больных с гнойно-воспалительными заболеваниями достигает 40% среди всех общехирургических больных [9]. Помимо традиционной хирургической обработки, на сегодняшний день разработано множество способов системного и локального воздействия на раневой процесс [8]. Эффективность и безопасность внедряемых препаратов или способов физической обработки ран должна быть объективно обоснована в рамках доклинических исследований. С этой целью разрабатываются и совершенствуются экспериментальные модели, имитирующие различные виды раневого процесса [2;4;5;12].

Способ моделирования экспериментальных ран определяется в соответствии с задачами, стоящими перед конкретным исследованием. Существуют различные варианты моделей гнойных ран: поверхностные дефекты кожи и расположенные в толще тканей (с формированием абсцесса или флегмоны), острые раны и раны с замедленным заживлением, в том числе осложненные ишемией, гипергликемией или другими факторами [1;6;11;12;16]. Способы контаминации раневых дефектов и разновидности вносимых возбудителей также могут отличаться, но в итоге должны приводить к одному результату – воспалению тканей с формированием гнойного экссудата.

При моделировании длительно незаживающих дефектов мягких тканей, важным элементом является создание нарушений локальной трофики тканей и предотвращение естественной контракции краёв раны [14]. Это достигается различными способами: наложением жгутов, перевязкой питающих сосудов, наложением кисетных швов в паравульнарной зоне, а также подшиванием краев раны к различным контурам или фасциальному ложу [5; 7; 10; 15: 16]. Степень ишемии тканей может значительно варьировать, в связи с чем, необходимо иметь возможность объективно оценивать вызванные нарушения микроциркуляции.

Несмотря на множество существующих моделей гнойных ран, в подавляющем большинстве способов не предусмотрена возможность формирования одинаковых по форме и размеру раневых дефектов, что не отвечает требованиям повторяемости эксперимента. Другим важным аспектом является обеспечение защиты раневого дефекта от внешних воздействий, а также выбор размера и локализации раневого дефекта на теле экспериментального животного. Во многих методиках применяются марлевые повязки или пластыри, которые недостаточно надежно фиксируются к коже и часто срываются самими животными в ходе исследования, что также отрицательно сказывается на стандартизации условий эксперимента.

Учитывая вышеописанные особенности, остаётся актуальным необходимость совершенствования моделей осложненного раневого процесса для решения прикладных задач и изучения эффективности новых лечебных средств.

Цель

Разработать экспериментальную модель трофической гнойной раны, и оценить возможность её использования для изучения воздействия различных факторов на раневой процесс.

Методы

Модель была апробирована на здоровых нелинейных белых крыса (самцы), массой от 180 г до 210 г, всего 10 животных. Все манипуляции выполняли с соблюдением общепринятых этических норм и требований. Все манипуляции выполняли с соблюдением требований декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (Хельсинки, 2000), а также в соответствии с требованиями приказа №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г. «Правила по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных», после одобрения исследования локальным этическим комитетом ФГБУ «ГВКГ им. Н.Н. Бурденко».

Формирование модели проводили с использованием пластинки из термостойкого силикона в форме диска толщиной 2 мм и диаметром 40 мм. В центре пластинки вырезали отверстие диаметром 24 мм, таким образом, чтобы выкраиваемая часть оставалась соединенной с основой (Рис.1).

Перед выполнением модели крыс вводили в наркоз по одной из стандартных методик. Животных фиксировали спинкой кверху. В межлопаточной области очищали от шерсти участок размером 6х4 см, после чего наносили спиртовым маркером контуры раны диаметром 16 мм. В асептических условиях после обработки операционного поля раствором антисептика, иссекали полнослойный лоскут до фасции по нанесённым контурам. Края раны фиксировали узловыми швами к краям центрального отверстия силиконового диска. Наружный край приспособления подшивали к коже животного узловыми швами до прилегания, а вокруг диска накладывали третий ряд швов через кожу с захватом подлежащих мягких тканей. Таким образом, благодаря разности диаметров дефекта и центрального отверстия диска, края раны равномерно растягивались, что позволяло создавать заданную площадь и форму, а также вызывать ишемию тканей вследствие натяжения. Второй и третий ряд швов вызывали дополнительное нарушение локальной микроциркуляции. Центральная часть силиконового диска обеспечивала защиту раны от внешних воздействий (Рис.2). Далее, на дне раны рассекали фасцию диаметральным разрезом, после чего мягкие ткани однократно раздавливали зажимом Кохера. В сформированный дефект мягких тканей вносили суточную культуру St. aureus (25923) в количестве 2,5х10⁷ КОЕ и укладывали фрагмент марлевой салфетки 2х2 см, после чего закрывали и фиксировали крышку силиконового диска стерильным пластырем [17].

Развитие локальной ишемии в тканях экспериментальных ранах подтверждали с помощью средств объективного контроля. У всех животных с помощью портативного тепловизора определялась температура на поверхности раны до и после моделирования трофических нарушений. Также проводился люминесцентный анализ с использованием интраоперационного щупа (ГОИ им. Вавилова). Интенсивность вторичной флуоресценции регистрировали после внутривенного введения в хвостовую вену крысы раствора флуоресцеина натрия в стандартной дозе 15 мг/кг массы животного.

 

Через 48 часов для оценки качества и подтверждения воспроизводимости модели выполняли ряд объективных диагностических исследований. Проводили визуальную оценку с описанием характера экссудата и планиметрия экспериментальных ран по цифровым фотографиям с помощью компьютерной программы ImageJ. Брали посевы из ран с качественным и количественным исследованием микрофлоры. Уровень обсемененности анализировали полуколичественным методом с диапазонами: 0 – нет роста; + - до 10³ КОЕ; ++ - от 10³ КОЕ до 10⁵ КОЕ; +++ - более 10⁵  КОЕ. Выполняли цитологическое исследование мазков-отпечатков раневой поверхности по методу М.П. Покровской и М.С. Макарова с определением типа цитограммы, а также морфологическое исследование биоптатов из ран с помощью световой и электронной микроскопии.

Результаты

При сравнении данных полученных путём термометрии до и после выполнения пособия имитирующего ишемические нарушения были получены различия температуры тела у животных. Исходная температура на поверхности раневого дефекта составляла 37,7 ± 0,4 градусов, а после подшивания силиконового кольца и наложения ишемизирующих швов данный показатель снижался до 35,8 ± 0,3 градусов (p < 0,05).

Отмечено достоверное снижение уровня флуоресценции в эксцизионной ране и ближайшей паравульнарной зоне (p< 0,01) в сравнении с контролем. Изучение динамики накопления и выведения индикатора из тканей выявили замедленную элиминацию флуорохрома.

Через 48 часов после формирования модели у всех животных наблюдали характерную картину, соответствующую осложненной инфицированной ране с отёчными краями и гнойно-фибринозным налётом (Рис. 3).

При бактериологическом контроле на вторые сутки у большинства (80,0%) животных наблюдалась высокая степень обсеменённости раны (более 10⁵ КОЕ), а у остальных в пределах от 10³ КОЕ до 10⁵ КОЕ. Качественный состав флоры закономерно представлен монокультурой St.aureus, внесенной ранее.

По результатам цитологического анализа на первые сутки выявлялось преобладание дегенеративно-воспалительного (58,7%) и некротического (41,3%) типов, характерных для гнойного процесса.

Гистологическая картина соответствовала осложненному бактериальному воспалительному процессу. Наблюдалось угнетение фагоцитарной функции клеток, о чем свидетельствовало небольшое количество фагосом, фаголизосом и деструкция органелл. На незавершенный фагоцитоз указывало отсутствие деструктивных изменений в фагоцитированных микробных клетках, сохранивших свою жизнеспособность. При электронно-микроскопическом исследовании обнаруживались скопления микробов, заключенных в многослойную биопленку (Рис. 4).

Заключение

Данные, полученные в ходе анализа предложенной экспериментальной модели, подтвердили её качество, простоту и воспроизводимость. Применение силиконового диска предотвращало контракцию раны и вместе с другими, осложняющими раневой процесс, факторами приближало её к клинической форме трофической язвы. Формирование признаков гнойного воспаления через 48 часов после формирования модели было подтверждено визуально, а также с помощью бактериологического, цитологического и морфологических методов исследования. Разработанный способ успешно был применён в ходе экспериментального исследования по изучению влияния высокоинтенсивного эрбиевого лазера на осложнённый раневой процесс и может быть рекомендован для других подобных исследований. Способ может быть рекомендован для исследования затяжного раневого процесса, а так же влияния на него различных факторов.

Об авторах

Александр Евгеньевич Зайцев

Филиал ФГБ ВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» Минобороны России, Москва

Email: doc.zaitsev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8728-6870
SPIN-код: 4831-3770

Внешний соискатель кафедры хирургии с курсом онкологии и лучевой диагностики, начальник хирургического отделения 

Россия, 107392, Россия, Москва, ул. М. Черкизовская, 7

Олег Николаевич Асанов

Филиал ФГБ ВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» Минобороны России, Москва

Email: oleg.asanov@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-4741-3932

Россия, 107392, Россия, Москва, ул. М. Черкизовская, 7.

Никита Игоревич Мясников

«Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» Минобороны России, Москва

Автор, ответственный за переписку.
Email: per.asper@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1943-2829
SPIN-код: 3801-0559

Слушатель адъюнктуры

194044, г. Санкт-Петербург, улица Академика Лебедева, дом 6

Список литературы

Дополнительные файлы