Сравнительное изучение реакции тканей на имплантацию двухкомпонентных кровоостанавливающих губок на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в хроническом опыте in vivo

Полный текст

Введение. В настоящее время случаи повреждения паренхиматозных органов по различным причинам как: техногенные катастрофы, криминальные происшествия, вооруженные конфликты, увеличение хирургической активности  распространенным явлением. Наиболее часто повреждение происходит в результате травм и различных оперативных вмешательств. В практике, для остановки кровотечения, хирурги наиболее часто прибегают к наложению хирургических швов и электрокоагуляции, что является дополнительным травмирующим фактором для печени, вызывает закономерные посттравматические явления воспалительного характера, результирующим осложнением которых является развитие спаечного процесса [1, 2].        

Даже с учетом современных методов проведения оперативных вмешательств при травме паренхиматозных органов (использование эндовидеохирургических технологий) и применения различных материалов (гемостатических губок, мембран, гелей и т.п.), не всегда удается полностью исключить диффузное кровотечение, результатом которого, в дальнейшем, является выпадение фибрина и образование спаек [3, 4, 13]. Данное осложнение наиболее вероятно при «открытом» способе проведения операции. Это обуславливается травмированием брюшины при ее рассечении и фиксации инструментами, иссечении участков брюшины и воздействием на нее сухими марлевыми салфетками [5, 15].

В современной хирургической практике при остановке кровотечений из паренхиматозных органов все чаще используют различные аппликационные кровоостанавливающие средства. Наибольшее распространение для этих целей получили гемостатические губки [6, 14].  При изготовлении губок  в качестве основы используют множество материалов – коллаген, медицинский желатин, карбоксиметилцелюлозу. Для увеличения эффективности кровоостанавливающих средств производители добавляют в их состав различные лекарственные вещества (транексамовая кислота, аминокапроновая кислота и др.), а также изделия подвергаются различным химическим и физическим воздействиям, меняющим их физико-химические свойства, например, уровень pH [7, 8].

Преимущество такого способа остановки кровотечения в том, что средства, имеющие структуру губки  обладают высокой степенью адгезии к раневой поверхности. Это позволяет применять их без дополнительной фиксации швами и дополнительной травматизации окружающих тканей [9, 16, 17]. Так же, за счет пористой структуры материала, изделие способно впитывать объемы крови, кратно превышающие ее изначальную массу без изменения объема. Ещё одним положительным фактором этого класса изделий является их способность к биодеградации – исчезновение следов применения уже после 7 дня после операции [10].

Исходя из вышесказанного, разработка новых подходов к изготовлению и изучению эффективности и безопасности образцов кровоостанавливающих губок, их влияния на развитие спаечного процесса, является актуальным вопросом абдоминальной хирургии.

Цель исследования - сравнительное изучение реакции тканей организма на имплантацию гемостатических губок на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) в хроническом опыте in vivo.

Материалы и методы. В качестве сравниваемых материалов использовали: 1 группа – Двухкомпонентное губчатое гемостатическое средство на основе Na-КМЦ (опытный образец); 2 группа – Губка гемостатическая коллагеновая (ЗАО «Зелёная дубрава», Россия); 3 группа – «ТахоКомб» (Takeda, Австрия); 4 группа - Surgicel Fibrillar (Johnson&Johnson, США).

Таблица 1. Распределение образцов на группы исследования

Table 1. Distribution of samples into study groups

 

Состав опытного образца разработан совместно с сотрудниками кафедры биологической и химической технологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России и кафедры химии ФГБОУ ВО КГУ (Курск, Россия) на базе лаборатории НИИ ЭМ КГМУ.

Двухкомпонентное губчатое гемостатическое средство на основе Na-КМЦ представляет собой двуслойную структуру с длиной стороны 5 см, толщиной 1 см, состоящую из натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы средней (400-800 сР) и высокой (1100-1900 сР) вязкости. Сторона губки из Na-КМЦ средней вязкости прикладывается непосредственно на раневую поверхность, другая сторона обращена кнаружи. Поскольку сторона со средней степенью вязкости обладает высоким уровнем адгезии, а так же быстро биодеградирует используется с целью обеспечения гемостаза.  сторона с высокой степенью вязкости, имеющая низкую скорость биодеградации,  является барьером для формирования спаек.

В стерильных условиях операционного блока лаборатории экспериментальной хирургии и онкологии НИИ ЭМ КГМУ Минздрава России выполняли оперативное вмешательство 12 кроликам-самцам породы «Советская шиншилла» (по 3 животных в каждой экспериментальной группе согласно числу видов тестируемых материалов). При планировании исследования руководствовались принципом «3R» (replacement – замена болезненных для животных экспериментов опытами, не причиняющими страданий; reduction – уменьшение числа опытов с животными; refinement – улучшение методики с целью облегчения страданий подопытных животных). Для расчета минимального количества животных выполняли формулу:

n=,

где n – число животных в каждой группе; zα и zβ – критические значения нормального распределения, соответствующие заданным уровням ошибок I и II рода; δ – разница измеряемых величин (µ2 – µ1); σ – стандартное отклонение, полученное в результате пилотного исследования [18].

Исследование выполнялось с соблюдением норм регионального этического комитета при ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, протокол № 2 от 5 марта 2018 г, приказ Минздрава РФ от 01.04.2016 N 199Н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики"; - ГОСТ 31891-2012 "Применение Принципов GLP к исследованиям in vitro" - ГОСТ 33215-2014 от 07.01.2016 г. «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. ГОСТ 33216-2014 «Правила работы с лабораторными грызунами и кроликами.»; Руководства по содержанию и использованию животных для экспериментов и в научных целях. FELASA, 2007 г. - Директивы 2010/63/EU ЕВРОПЕЙСКОГО ПАРЛАМЕНТА И СОВЕТА ЕВРОПЕЙСКОГО СОЮЗА от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях (Соответствует требованиям Европейской экономической зоны) - Решения коллегии евразийской экономической комиссии от 13 февраля 2018 г. N 27 «Об утверждении единых ветеринарных (ветеринарно-санитарных) требований, предъявляемых к объектам, подлежащим ветеринарному контролю (надзору)» - Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях Страсбург, 18 марта 1986 года.

 Для обеспечения анестезиологического пособия использовался ингаляционный масочный наркоз: концентрация изофлюрана во вдыхаемой газовой смеси – 3%, поток воздуха – 1 л/мин. Применяли наркозный аппарат RWD Life Science R340 Isoflurane. Все этапы экспериментального исследования были проведены с соблюдением международных и отечественных норм гуманного обращения с лабораторными животными.

Во время операции животное располагалось лежа на спине, конечности были зафиксированы к операционному столу. После стандартной трехкратной обработки операционного поля выполнялась срединная лапаротомия с последующим выведением печени в операционную рану и отграничение салфетками, смоченными физиологическим раствором. Для моделирования раневого процесса использовали трафарет с отверстием квадратной формы размером 1х1 см. Выполняли поверхностное травмирование ткани печени (иссечение), выступающей через отверстие при надавливании на трафарет. После этого, к кровоточащей ране прикладывали исследуемые изделия, соответствующие площади раневого процесса (1х1 см) (Рис.1). При использовании двухкомпонентного гемостатического средства на основе Na-КМЦ, учитывали специфику его применения – изделие прикладывали стороной, изготовленной из полимера с более низкой вязкостью (окрашена фукорцином). На 1, 3, 7 и 14 сутки после операции каждому животному производили контрольно-динамическую лапароскопию (КДЛ) (выполняли фото- и видеопротоколирование операций), при которой макроскопически оценивали: наличие/отсутствие локальных или диффузных признаков воспаления, морфологию и выраженность спаечного процесса. Доступ при КДЛ выполняли на 2 см выше лонного сочленения. Для наложения карбоксиперитонемума использовали универсальный троакар с газоподачей (5мм). Видеорегистрация проводилась с помощью эндоскопической видеокамеры (ВК-01-«Крыло», г. Воронеж, Россия).

Рисунок 1. Этапы выполнения оперативного вмешательства:

a - моделирование травмы печени с использованием трафарета; b - аппликация гемостатического материала; c - ушитая лапаротомная рана в верхне-срединном сегменте; d - выполнение КДЛ

Figure 1. Stages of surgical intervention:

a - modeling of liver injury using a stencil; b - application of hemostatic material; c - sutured abdominal wound in the upper-middle segment; d - performance of CDL

 

По завершению хронического опыта животные были выведены из эксперимента путем CO2-индуцированной эвтаназии [11].

Шкала оценки выраженности спаечного процесса проводилась на основании методики (Аюшинова Н.И., Шурыгина И.А., Григорьев Е.Г.) (Таблица 2) [12]. Баллы присваивали в результате контрольной диагностической лапароскопии, выполненной на сроках согласно дизайну исследования.

Таблица 2. Макроскопическая шкала оценки выраженности спаечного процесса в брюшной полости

 

Table 2. Macroscopic scale for the assessment of abdominal adhesive process severity

 

Статистическую обработку данных проводили при помощи программы «Statictica 13.3»  (Dell Software Company, Round Rock, Texas, United States of America).  Учитывая качественный оценочный характер данных, для определения уровня их статистической значимости использовали критерий χ2. При проверке статистической гипотезы, критический уровень значимости (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение. При детальном анализе данных КДЛ у животных экспериментальной группы № 1, которым имплантировали материалы на основе Na-КМЦ для остановки кровотечения из раны печени, на 1-е сутки отмечалось отсутствие активного кровотечения, но обнаруживались сгустки нелизированной крови на поверхности большого сальника и раневой поверхности печени. Также наблюдали наличие спаечного процесса между большим сальником, желудком, диафрагмой и передней брюшной стенкой, нитевидные спайки образовались также и между долями печени.

На 3-и послеоперационные сутки отмечалось уменьшение количества сгустков нелизированной крови. Отчетливо визуализировалась гиперемия участков органов, вовлеченных в спаечный процесс, увеличение количества тяжей, а также их утолщение.

На 7-е сутки была обнаружена новая спайка между передней брюшной стенкой и левой долей печени, выявленные на 3-и сутки спайки утолщены и васкуляризированы. Во время КДЛ сгустков крови в брюшной полости не обнаружено.

На 14-е сутки в динамике наблюдался процесс утолщения спаек, а также их васкуляризация (Рис. 2).

 

Рисунок 2. Лапароскопия, интраоперационное фото, группа  № 1: a - 1-е сутки после травмы печени, спайка между большим сальником и желудком; b – 1-е сутки после операции, спайки между большим сальником и передней брюшной стенкой ; c – 1-е сутки после травмы печени, спайка между долями печени; d – 3-и сутки после травмы печени, увеличение спаек в диаметре; i - 3-и сутки после травмы печени, увеличение количества спаек между большим сальником и передней брюшной стенкой;  f - 3-и сутки после травмы печени, увеличение количества спаек между долями печени; g - 7-е сутки после травмы печени, спайка между передней брюшной стенкой и долей печени; h - 14-е сутки после травмы печени

Figure 2. Laparoscopy, intraoperative photo, group 1: a - 1st day after liver injury, adhesions between the greater omentum and stomach; b - 1st day after surgery, adhesions between the greater omentum and anterior abdominal wall; c - 1st day after liver injury, adhesions between liver lobes; d - 3rd day after liver injury, increase in diameter of adhesions; i - 3rd day after liver injury, increased number of adhesions between the greater omentum and the anterior abdominal wall; f - 3rd day after liver injury, increased number of adhesions between the liver lobes; g - 7th day after liver injury, adhesions between the anterior abdominal wall and the liver lobe; h - 14th day after liver injury.

При оценке материалов, полученных в ходе выполнения КДЛ, во 2 группе (Губка кровоостанавливающая коллагеновая, ЗАО «Зелёная дубрава», Россия), были получены следующие результаты: на 1 сутки после оперативного вмешательства наблюдалось образование спаек между большим сальником, тонким кишечником и передней брюшной стенкой, а также между печенью и желудком. Данный паттерн распространения характерен и для Na-КМЦ. Помимо этого, в боковых каналах и в месте операционной травмы наблюдались сгустки нелизированной крови.

На 3-и сутки наблюдалось снижение выраженности гиперемии сальника и тонкого кишечника и наличие участков организации тканей в области нанесения раны. Стоит отметить, что при использовании Na-КМЦ такой характер распространения фибрина не свойственен. Сгусток крови определялся только в месте раневого процесса. Спаечный процесс между большим сальником и передней брюшной стенкой без изменений.

На 7-е сутки наблюдался полный лизис кровяных сгустков, обнаруженных на ранних сроках. Отмечалось развитие спаечного процесса между печенью и петлями тонкого кишечника. Динамика спаечного процесса между передней брюшной стенкой, большим сальником и тонким кишечником отсутствует, отмечено усиление степени васкуляризации.

На 14-е сутки отмечалась неизменная выраженность спаечного процесса в сравнении с более ранними сроками (Рис.3).

 

Рисунок 3. Лапароскопия, интраоперационное фото, группа  № 4: a- 1-е сутки после травмы печени, круглая спайка между печенью и желудком; b – 1-е сутки после операции, спайка между большим сальником, тонким кишечником и передней брюшной стенкой; c – 3-и сутки после травмы печени; d – 3-и сутки после травмы печени кровяной сгусток в смоделированной травме; i - 7-е сутки после травмы печени; f - 14-е сутки после травмы печени

Figure 3: Laparoscopy, intraoperative photo, group 4: a- 1st day after liver injury, circular adhesion between liver and stomach; b- 1st day after surgery, adhesion between the greater omentum, small intestine and anterior abdominal wall; c- 3rd day after liver injury; d- 3rd day after liver injury blood clot in simulated injury; i- 7th day after liver injury; f- 14th day after liver injury

На 1-е сутки (на основании видео- и фотоданных, полученных в ходе КДЛ), в отличии от экспериментальной группы № 1, при использовании средств группы 3 (ТахоКомб), нелизированные сгустки крови распространены в брюшной полости в большей степени, нежели в других группах исследования. За счёт одного из них наблюдалась адгезия левой доли печени к передней брюшной стенке. Очагов активного кровотечения и гиперемии не обнаружено. Образован конгломерат спаек между брюшиной, большим сальником, желудком, толстым кишечником и печенью.

На 3-е послеоперационные сутки нелизированные сгустки крови в брюшной полости и на раневой поверхности остались без видимых изменений, в отличии от Na-КМЦ, где их количество наблюдалось в меньшей степени. Отмечалось утолщение уже имеющихся спаек, образование круглых плоских спаечных сращений между желудком и печенью, а также визуализировался процесс распространения соединительной ткани.

На 7-е сутки при выполнении КДЛ отмечалось распространение мелких полупрозрачных спаек между долями печени. Наличие “старых” сгустков крови не вявлено. Также как и в 1 экспериментальной группе, на данном сроке наблюдалась гиперемия органов, однако, она имела более интенсивный характер.

На 14-е сутки макроскопическая картина схожа с группой, где использовалась Na-КМЦ (наблюдался процесс утолщения спаек с их васкуляризацией) (Рис.4).

 

Рисунок 4. Лапароскопия, интраоперационное фото, группа № 4: a- 1-е сутки после травмы печени, конгломерат спаек; b – 3-и сутки после операции; c – 7-е сутки после травмы печени; d – 14-е сутки после травмы печени;

Figure 4: Laparoscopy, intraoperative photo, group 4: a- 1st day after liver injury, adhesions conglomerate; b- 3rd day after surgery; c- 7th day after liver injury; d- 14th day after liver injury;

В 4-й группе (Surgicall Fibrillar), так же как и в 1-й экспериментальной группе, на 1-е сутки отмечалось отсутствие активного кровотечения (нет признаков свежей крови в брюшной полости), но визуализировалось наличие небольшого количества «старой», еще нелизированной крови. Обнаружено значительное количество белесоватых пятен, свидетельствующих о наличии налета фибрина. Между поверхностью печени и сальником сформировались рыхлые незрелые спайки.

На 3-и послеоперационные сутки отмечалось уменьшение площади сгустка крови между печенью и передней брюшной стенкой. Течение спаечного процесса не имело выраженной динамики 1-е сутки.

Результаты 7-х суток после выполнения вмешательства схожи с результатами 1-й экспериментальной группы на аналогичном сроке (лизис сгустков крови). Визуализировалось увеличение площади спаечного процесса. На этом сроке спайки выглядели массивными, плотными и представляли собой шнуровидные тяжи, наблюдалось начало васкуляризации спаек.

На 14-е сутки после нанесения травмы печени лабораторному животному в процессе выполнения КДЛ прослеживалось усиление васкуляризации спаек и увеличение их в размерах. Но в отличии от результатов в группе 1 (Двуслойная гемостатическая губка на основе Na-КМЦ) было выявлено распространение спаечного процесса на соседние органы и ткани.  Новые спайки образовались на месте кровяного сгустка между краем печени и передней брюшной стенкой (Рис.5).

 

Рисунок 5. Лапароскопия, интраоперационное фото, группа № 4: a- 1-е сутки после травмы печени;    b – 3-и сутки после травмы печени; c - 7-е сутки после травмы печени; d - 14-е сутки после травмы печени.

Figure 5: Laparoscopy, intraoperative photo, group #4: a- 1st day after liver injury; b- 3rd day after liver injury; c- 7th day after liver injury; d- 14th day after liver injury.

Таблица 3. Распространенность спаечного процесса в брюшной полости лабораторных животных после вмешательства

Table 3. Prevalence of adhesions in the abdominal cavity of laboratory animals after intervention

 

Примечание: * – статистически значимые значения (p≤0,05), p1 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 2, p2 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 3, p3 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 4, p4 – уровень значимости при сравнении групп №2 и №3, p5 – уровень значимости при сравнении групп №2 и №4, p6 – уровень значимости при сравнении групп №3 и №4.

Note: * - statistically significant values (p≤0.05), p1 - significance level when comparing groups #1 and #2, p2 - significance level when comparing groups #1 and #3, p3 - significance level when comparing groups #1 and #4, p4 - level when comparing groups #2 and #3, p5 - level when comparing groups #2 and #4, p6 - level when comparing groups #3 and #4.

Таблица 4. Макроморфология спаек в брюшной полости лабораторных животных

Table 4: Macromorphology of adhesions in the abdominal cavity of laboratory animals, n

 

Примечание: * – статистически значимые значения (p≤0,05), p1 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 2, p2 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 3, p3 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 4, p4 – уровень значимости при сравнении групп №2 и №3, p5 – уровень значимости при сравнении групп №2 и №4, p6 – уровень значимости при сравнении групп №3 и №4.

Note: * - statistically significant values (p≤0.05), p1 - significance level when comparing groups #1 and #2, p2 - significance level when comparing groups #1 and #3, p3 - significance level when comparing groups #1 and #4, , p4 - level when comparing groups #2 and #3, p5 - level when comparing groups #2 and #4, p6 - level when comparing groups #3 and #4.

Таблица 5. Количество спаечных сращений в брюшной полости лабораторных животных после вмешательства

Table 5. The number of adhesions in the abdominal cavity of laboratory animals after the intervention

 

Примечание: * – статистически значимые значения (p≤0,05), p1 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 2, p2 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 3, p3 – уровень значимости при сравнении групп № 1 и № 4, p4 – уровень значимости при сравнении групп №2 и №3, p5 – уровень значимости при сравнении групп №2 и №4, p6 – уровень значимости при сравнении групп №3 и №4.

Note: * - statistically significant values (p≤0.05), p1 - significance level when comparing groups #1 and #2, p2 - significance level when comparing groups #1 and #3, p3 - significance level when comparing groups #1 and #4, , p4 - level when comparing groups #2 and #3, p5 - level when comparing groups #2 and #4, p6 - level when comparing groups #3 and #4.

Выводы. Таким образом, при внутригрупповом сравнении Na-КМЦ с остальными образцами, были обнаружены статистически значимые различия с 4 экспериментальной группой («Surgicel Fibrillar»). Выраженность спаечного процесса после применения разработанного образца в 1,3 раза ниже (p≤0,05), чем во всех группах сравнения. Это объясняется лучшей стабильностью разработанного средства. Na-КМЦ средней вязкости обеспечивает гемостатический эффект, а слой из того же полимера, но высокой вязкости, образует барьер для формирования спаек.

Учитывая полученные данные, в зависимости от выраженности индуцированного травмой и имплантацией спайкообразования, экспериментальные группы можно расположить в следующем порядке: 1→2→3→4. Следовательно, наименьшей распространенностью и выраженностью спаечного процесса в брюшной полости лабораторных животных после вмешательства обладают образцы на основе Na-КМЦ. Об этом свидетельствует статистически значимое (р≤0,05) уменьшение проявления спайкообразования в сравнении со средствами: «Surgicel Fibrillar».

Во всех случаях спаечного процесса были обнаружены шнуровидные спайки, морфологическим субстратом которых являлась прядь большого сальника. Однако, даже с учетом наличия спаечного процесса в брюшной полости сращения не вызывали расстройств пропульсивной функции кишечника и спаечной кишечной непроходимости, никак клинически не проявлялись.

Об авторах

Вячеслав Александрович Липатов

Курский государственный медицинский университет

Email: drli@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6121-7412
SPIN-код: 1170-1189
Scopus Author ID: 6603948707
ResearcherId: D-8788-2013

д.м.н., профессор, проректор по научной работе и инновационному развитию

Россия, 305041, Курск, ул. Карла Маркса, 3

Александр Анатольевич Панов

Курский государственный медицинский университет

Email: al-panoff@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8275-1697

Очный аспирант кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии

Россия, 305041, Курск, ул. Карла Маркса, 3

Артём Александрович Денисов

Курский государственный медицинский университет

Email: d.artyom21@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5034-8580

Ассистент кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии

Россия, 305041, Курск, ул. Карла Маркса, 3

Владимир Владимирович Похожай

Гомельский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: universum1988@ya.ru
ORCID iD: 0000-0001-6866-547X

к.м.н., доцент, проректор по лечебной работе

Россия, Беларусь, Гомель, ул. Ланге 5

Список литературы

Дополнительные файлы