The question of the influence of the dosed tissue stretching on the concentration of the hypoxia-inducible factor (HIF-1α) in the stretched flap

Full Text

Закрытие раневых дефектов мягких тканей является одной из «вечных» актуальных проблем хирургии. Для сведения краев раны с середины ХХ века широко используется дозированное тканевое растяжение с использованием различных технических приспособлений [1, 2, 3, 4]. Вместе с ростом частоты применения способа все глубже исследовались сопутствующие ему феномены, и, в первую очередь, – тканевая гипоксия, возникающая в процессе растяжения в результате уменьшения диаметра сосудов [5]. Гистологическими исследованиями установлено, что при дозированной тракции в сосудах дермы и подкожной клетчатки не выявляется значимых структурных повреждений, наоборот, в растягиваемой ткани выявляется быстрая пролиферация кровеносных сосудов
[6, 7]. В условиях гипоксии активность пролиферативных процессов и ангиогенез, то есть развитие новых сосудов из уже имеющихся, регулируются открытым в 1992 году американским ученым G.L. Semenza цитокином – гипоксией индуцибельным фактором
(HIF-1α) [8]. Многочисленные публикации посвящены результатам исследований влияния HIF-1α на ангиогенез [9], заживление ран [10, 11], однако отсутствуют данные о влиянии тканевого растяжения на концентрацию HIF-1α в области растягиваемого лоскута. Представленное экспериментальное исследование посвящено поиску ответа на этот вопрос.
Материалы и методы
Объектом исследования в эксперименте явилась инфицированная рана мягких тканей, закрытие которой осуществлялось методом тканевого растяжения. Предметом исследования послужила концентрация цитокина HIF-1α в коже дистрагируемого лоскута в условиях локальной циркуляторной гипоксии. Задачей экспериментального исследования явилось: изучение влияния локальной циркуляторной гипоксии, возникающей при тканевом растяжении, на концентрацию цитокина HIF-1α в кожном лоскуте. Научная гипотеза заключалась в том, что при дозированном тканевом растяжении и возникновении локальной циркуляторной компенсированной гипоксии происходит увеличение концентрации цитокина HIF-1α (гипоксией индуцибельного фактора) в области дистрагируемого кожного лоскута. Критерием моделирования условий локальной компенсированной гипоксии явились данные лазерной допплеровской флоуметрии. Критерием, позволяющим подтвердить или опровергнуть предложенную гипотезу, явились данные иммуноферментного анализа (а именно, концентрация HIF-1α в группах сравнения).
При проведении экспериментальных исследований использовали 18 экспериментальных животных (крыс) массой 250-300 г. Экспериментальные исследования включали в себя выполнение следующих этапов:
Моделирование стандартной инфицированной раны подопытным животным.
Моделирование дозированного тканевого растяжения аппаратным способом с оставлением устройства на 24 часа.
Иммуноферментный анализ образцов кожи животного до начала растяжения тканей, а также через 30 минут и 24 часа дозированного растяжения.
Статистическая обработка результатов исследования.
Всем животным выполняли анестезию путем введения Золетила (50 мг/кг веса, внутрибрюшинно), Рометара (0,2 мл/кг, внутрибрюшинно). Для моделирования раны после предварительной депиляции в межлопаточной области, обработки операционного поля раствором антисептика (спиртовой раствор хлоргексидина) на кожу наносили предварительную разметку круглой формы по шаблону диаметром 18мм. Острым скальпелем по разметке иссекали кожу и фасцию, формируя рану глубиной до мышц. У всех экспериментальных животных определяли исходный уровень концентрации HIF-1α в дерме перед тканевым растяжением. С целью моделирования процесса тканевого растяжения и создания условий локальной циркуляторной гипоксии использовали специальное устройство, включающее металлическую рамку размером 5х3 см, выполненную из спицы Киршнера, и медицинских инъекционных игл. Две инъекционные иглы проводили интрадермально, параллельно с обоих краев раны. Учитывая повышенную, по сравнению с человеческой, мобильность кожного покрова крыс, тракцию кожи осуществляли в сторону, противоположную центру раны за третью иглу, проведенную на расстоянии 2 см от иглы, наложенной у краниального края раны. Точками опоры, к которым фиксировали иглы и по направлению к которым осуществлялась тяга, являлась металлическая рамка. Направление тракции от раневого дефекта к периферии исключало сближение краев раны (рис. 1).
Состояние микроциркуляции в области растягиваемого кожного лоскута контролировали при помощи лазерной допплеровской флоуметрии (аппарат ЛАКК-02). Дистракцию кожного лоскута проводили до тех пор, пока показатель микроциркуляции (ПМ) не снизится на 40-50 % от исходного (рис. 2), после чего иглы фиксировали помощью лигатур и проволоки к металлической рамке.
Для проведения иммуноферментного анализа с целью определения концентрации HIF-1α в дистрагируемом лоскуте у 9 животных формировали образцы кожи околораневой области через 30 минут и у 9 животных – через 24 часа от начала тканевого растяжения. Содержание HIF-1α в коже экспериментальных животных определяли методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора ELISA Kit for Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha (HIF-1α) Кат.SEA798Ra для гомогенатов тканей фирмы Cloud-Clone Corp (КНР) (рис. 3).
Для статистической обработки полученных данных использовали компьютерную программу Statistica 6.0. Для оценки статистической значимости различий при сравнении групп по количественному признаку в связанных группах использовали непараметрический критерий Вилкоксона. Выборочные параметры, приводимые далее, имеют следующие обозначения: Ме – медиана, Q1 – верхний квартиль, Q3 – нижний квартиль, n – объем анализируемой подгруппы, р – величина статистической значимости различий. Критическое значение уровня значимости принимали равным 5 % (р≤0,05).
Результаты и обсуждение
Растяжение кожи под контролем лазерной допплеровской флоуметрии до уровня 50 % от исходного показателя микроциркуляции не вызвало критического нарушения кровоснабжения с необратимыми последствиями. Несмотря на то, что всем экспериментальным животным выполнялась полная или частичная мобилизация лоскута (под контролем лазерной допплеровской флоуметрии), появления некрозов не наблюдалось ни в одном случае. У всех животных в процессе дозированного тканевого растяжения зафиксировано увеличение концентрации HIF-1α в дистрагируемом лоскуте по сравнению с исходными данными. Исходная концентрация HIF-1α в дерме до начала дермотензии составляла (Ме [Q1; Q3]) 110 [98, 1; 114, 8] нг/мл. В группе животных, которым выполняли тканевое растяжение в течение 30 минут зафиксировано статистически значимое увеличение концентрации HIF-1α до 148 [122, 2; 221, 7] нг/мл (р=0,008). При анализе результатов иммуноферментного анализа дистрагируемого лоскута, выполненного через 24 часа дозированного растяжения, выявлено, что концентрация HIF-1α увеличилась до 330 [246, 4; 463, 3] нг/мл (р=0,007).
Ранее в исследованиях, посвященных тканевому растяжению, на моделях животных и при исследовании тканей человека было показано увеличение митотической активности клеток базального слоя эпидермиса, достигающее максимума через 24–48 часа [12, 13]. Принимая во внимание результаты наших предыдущих исследований [14], где доказано усиление митотической активности в дистрагируемом лоскуте и раневом дефекте в условиях компенсированной тканевой гипоксии и на основе полученных данных можно предположить, что активность ангиогенеза и пролиферации при тканевом растяжении регулируется путем локального увеличения концентрации HIF-1α.
Очень важно при тканевом растяжении удерживать уровень гипоксии в границах компенсации, поскольку при чрезмерном растяжении кожи возможно формирование некрозов, а при недостаточной тракции кожи в условиях нормоксии цитокин HIF-1α распадается в течение 10 минут [15] Из литературных источников известно, что цитокин HIF-1α является критическим фактором, регулирующим адаптацию организма к условиям гипоксии. Отмечается прямая зависимость между содержанием цитокина HIF-1α и скоростью заживления ран [16, 17]. Описывается положительное влияние гипоксией-индуцибельного фактора на эпителизацию [18], на экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а, следовательно, на ангио- и васкулогенез [19]. Таким образом, цитокин HIF-1α является интегральным регулятором гомеостаза кислорода в тканях, а также управляет сотнями генов-мишеней и другими белками, связанными с энергетическим метаболизмом [20].
Полученные результаты, свидетельствующие об увеличении концентрации цитокина HIF-1a в области дистрагируемого лоскута, согласуются с данными Olenius M. et al. (1993), и подтверждают важную роль внераневого вставочного роста в закрытии раны [21]. Представленные результаты свидетельствуют о том, что концентрация цитокина HIF-1α увеличивается в условиях локальной циркуляторной компенсированной гипоксии при дозированной дермотензии.
Вывод
По данным иммуноферментного анализа в условиях дозированного тканевого растяжения при снижении показателя микроциркуляции в дистрагируемом лоскуте на 50 % от исходного происходит увеличение концентрации HIF-1α в тканях околораневой области.

About the authors

Maxim Vladimirovich Bagryantsev

City clinical hospital № 30, Moscow district, Nizhny Novgorod

Author for correspondence.
Email: maks-bagryancev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2230-9431
SPIN-code: 5557-6327

surgical Department, surgeon

Russian Federation, 603157, Russia, Nizhny Novgorod, Berezovskaya street, 85a

Ilia Viktorovich Pavlenko

City clinical hospital № 30, Moscow district, Nizhny Novgorod

Email: maks-bagryancev@mail.ru

surgical Department, surgeon

Russian Federation, 603157, Russia, Nizhny Novgorod, Berezovskaya street, 85a

Natalya Alexandrovna Shelchkova

Central Research Laboratory Nizhny Novgorod State Medicine Academy", Russia

Email: maks-bagryancev@mail.ru

candidate of biological Sciences, head of the Department of molecular and cellular technologies

Russian Federation, 603104, Russia, Nizhniy Novgorod, prospect Gagarina, d. 70

Andrey Alexandrovich Mironov

Nizhny Novgorod State University (NNSU); Central Research Laboratory Nizhny Novgorod State Medicine Academy"

Email: maks-bagryancev@mail.ru

PhD, professor assistent, Department of Neurotechnology; Senior researcher of Experimental Modeling Department

Russian Federation, 603022, Russia, Nizhniy Novgorod, prospect Gagarina, d. 23; 603104, Russia, Nizhniy Novgorod, prospect Gagarina, d. 70

Maxim Georgievich Ryabkov

City clinical hospital № 30, Moscow district, Nizhny Novgorod

Email: maks-bagryancev@mail.ru

doctor of medicine, consultant physician 1 surgical Department

Russian Federation, 603157, Russia, Nizhny Novgorod, Berezovskaya street, 85a

Vladimir Viktorovich Beschastnov

City clinical hospital № 30, Moscow district, Nizhny Novgorod

Email: maks-bagryancev@mail.ru

doctor of medicine, consultant physician 2 surgical Department

Russian Federation, 603157, Russia, Nizhny Novgorod, Berezovskaya street, 85a

References

Supplementary files