К вопросу о влиянии дозированного тканевого растяжения на концентрацию гипоксией-индуцибельного фактора (HIF-1α) в дистрагируемом лоскуте

Полный текст

Закрытие раневых дефектов мягких тканей является одной из «вечных» актуальных проблем хирургии. Для сведения краев раны с середины ХХ века широко используется дозированное тканевое растяжение с использованием различных технических приспособлений [1, 2, 3, 4]. Вместе с ростом частоты применения способа все глубже исследовались сопутствующие ему феномены, и, в первую очередь, – тканевая гипоксия, возникающая в процессе растяжения в результате уменьшения диаметра сосудов [5]. Гистологическими исследованиями установлено, что при дозированной тракции в сосудах дермы и подкожной клетчатки не выявляется значимых структурных повреждений, наоборот, в растягиваемой ткани выявляется быстрая пролиферация кровеносных сосудов
[6, 7]. В условиях гипоксии активность пролиферативных процессов и ангиогенез, то есть развитие новых сосудов из уже имеющихся, регулируются открытым в 1992 году американским ученым G.L. Semenza цитокином – гипоксией индуцибельным фактором
(HIF-1α) [8]. Многочисленные публикации посвящены результатам исследований влияния HIF-1α на ангиогенез [9], заживление ран [10, 11], однако отсутствуют данные о влиянии тканевого растяжения на концентрацию HIF-1α в области растягиваемого лоскута. Представленное экспериментальное исследование посвящено поиску ответа на этот вопрос.
Материалы и методы
Объектом исследования в эксперименте явилась инфицированная рана мягких тканей, закрытие которой осуществлялось методом тканевого растяжения. Предметом исследования послужила концентрация цитокина HIF-1α в коже дистрагируемого лоскута в условиях локальной циркуляторной гипоксии. Задачей экспериментального исследования явилось: изучение влияния локальной циркуляторной гипоксии, возникающей при тканевом растяжении, на концентрацию цитокина HIF-1α в кожном лоскуте. Научная гипотеза заключалась в том, что при дозированном тканевом растяжении и возникновении локальной циркуляторной компенсированной гипоксии происходит увеличение концентрации цитокина HIF-1α (гипоксией индуцибельного фактора) в области дистрагируемого кожного лоскута. Критерием моделирования условий локальной компенсированной гипоксии явились данные лазерной допплеровской флоуметрии. Критерием, позволяющим подтвердить или опровергнуть предложенную гипотезу, явились данные иммуноферментного анализа (а именно, концентрация HIF-1α в группах сравнения).
При проведении экспериментальных исследований использовали 18 экспериментальных животных (крыс) массой 250-300 г. Экспериментальные исследования включали в себя выполнение следующих этапов:
Моделирование стандартной инфицированной раны подопытным животным.
Моделирование дозированного тканевого растяжения аппаратным способом с оставлением устройства на 24 часа.
Иммуноферментный анализ образцов кожи животного до начала растяжения тканей, а также через 30 минут и 24 часа дозированного растяжения.
Статистическая обработка результатов исследования.
Всем животным выполняли анестезию путем введения Золетила (50 мг/кг веса, внутрибрюшинно), Рометара (0,2 мл/кг, внутрибрюшинно). Для моделирования раны после предварительной депиляции в межлопаточной области, обработки операционного поля раствором антисептика (спиртовой раствор хлоргексидина) на кожу наносили предварительную разметку круглой формы по шаблону диаметром 18мм. Острым скальпелем по разметке иссекали кожу и фасцию, формируя рану глубиной до мышц. У всех экспериментальных животных определяли исходный уровень концентрации HIF-1α в дерме перед тканевым растяжением. С целью моделирования процесса тканевого растяжения и создания условий локальной циркуляторной гипоксии использовали специальное устройство, включающее металлическую рамку размером 5х3 см, выполненную из спицы Киршнера, и медицинских инъекционных игл. Две инъекционные иглы проводили интрадермально, параллельно с обоих краев раны. Учитывая повышенную, по сравнению с человеческой, мобильность кожного покрова крыс, тракцию кожи осуществляли в сторону, противоположную центру раны за третью иглу, проведенную на расстоянии 2 см от иглы, наложенной у краниального края раны. Точками опоры, к которым фиксировали иглы и по направлению к которым осуществлялась тяга, являлась металлическая рамка. Направление тракции от раневого дефекта к периферии исключало сближение краев раны (рис. 1).
Состояние микроциркуляции в области растягиваемого кожного лоскута контролировали при помощи лазерной допплеровской флоуметрии (аппарат ЛАКК-02). Дистракцию кожного лоскута проводили до тех пор, пока показатель микроциркуляции (ПМ) не снизится на 40-50 % от исходного (рис. 2), после чего иглы фиксировали помощью лигатур и проволоки к металлической рамке.
Для проведения иммуноферментного анализа с целью определения концентрации HIF-1α в дистрагируемом лоскуте у 9 животных формировали образцы кожи околораневой области через 30 минут и у 9 животных – через 24 часа от начала тканевого растяжения. Содержание HIF-1α в коже экспериментальных животных определяли методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора ELISA Kit for Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha (HIF-1α) Кат.SEA798Ra для гомогенатов тканей фирмы Cloud-Clone Corp (КНР) (рис. 3).
Для статистической обработки полученных данных использовали компьютерную программу Statistica 6.0. Для оценки статистической значимости различий при сравнении групп по количественному признаку в связанных группах использовали непараметрический критерий Вилкоксона. Выборочные параметры, приводимые далее, имеют следующие обозначения: Ме – медиана, Q1 – верхний квартиль, Q3 – нижний квартиль, n – объем анализируемой подгруппы, р – величина статистической значимости различий. Критическое значение уровня значимости принимали равным 5 % (р≤0,05).
Результаты и обсуждение
Растяжение кожи под контролем лазерной допплеровской флоуметрии до уровня 50 % от исходного показателя микроциркуляции не вызвало критического нарушения кровоснабжения с необратимыми последствиями. Несмотря на то, что всем экспериментальным животным выполнялась полная или частичная мобилизация лоскута (под контролем лазерной допплеровской флоуметрии), появления некрозов не наблюдалось ни в одном случае. У всех животных в процессе дозированного тканевого растяжения зафиксировано увеличение концентрации HIF-1α в дистрагируемом лоскуте по сравнению с исходными данными. Исходная концентрация HIF-1α в дерме до начала дермотензии составляла (Ме [Q1; Q3]) 110 [98, 1; 114, 8] нг/мл. В группе животных, которым выполняли тканевое растяжение в течение 30 минут зафиксировано статистически значимое увеличение концентрации HIF-1α до 148 [122, 2; 221, 7] нг/мл (р=0,008). При анализе результатов иммуноферментного анализа дистрагируемого лоскута, выполненного через 24 часа дозированного растяжения, выявлено, что концентрация HIF-1α увеличилась до 330 [246, 4; 463, 3] нг/мл (р=0,007).
Ранее в исследованиях, посвященных тканевому растяжению, на моделях животных и при исследовании тканей человека было показано увеличение митотической активности клеток базального слоя эпидермиса, достигающее максимума через 24–48 часа [12, 13]. Принимая во внимание результаты наших предыдущих исследований [14], где доказано усиление митотической активности в дистрагируемом лоскуте и раневом дефекте в условиях компенсированной тканевой гипоксии и на основе полученных данных можно предположить, что активность ангиогенеза и пролиферации при тканевом растяжении регулируется путем локального увеличения концентрации HIF-1α.
Очень важно при тканевом растяжении удерживать уровень гипоксии в границах компенсации, поскольку при чрезмерном растяжении кожи возможно формирование некрозов, а при недостаточной тракции кожи в условиях нормоксии цитокин HIF-1α распадается в течение 10 минут [15] Из литературных источников известно, что цитокин HIF-1α является критическим фактором, регулирующим адаптацию организма к условиям гипоксии. Отмечается прямая зависимость между содержанием цитокина HIF-1α и скоростью заживления ран [16, 17]. Описывается положительное влияние гипоксией-индуцибельного фактора на эпителизацию [18], на экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а, следовательно, на ангио- и васкулогенез [19]. Таким образом, цитокин HIF-1α является интегральным регулятором гомеостаза кислорода в тканях, а также управляет сотнями генов-мишеней и другими белками, связанными с энергетическим метаболизмом [20].
Полученные результаты, свидетельствующие об увеличении концентрации цитокина HIF-1a в области дистрагируемого лоскута, согласуются с данными Olenius M. et al. (1993), и подтверждают важную роль внераневого вставочного роста в закрытии раны [21]. Представленные результаты свидетельствуют о том, что концентрация цитокина HIF-1α увеличивается в условиях локальной циркуляторной компенсированной гипоксии при дозированной дермотензии.
Вывод
По данным иммуноферментного анализа в условиях дозированного тканевого растяжения при снижении показателя микроциркуляции в дистрагируемом лоскуте на 50 % от исходного происходит увеличение концентрации HIF-1α в тканях околораневой области.

Об авторах

Максим Владимирович Багрянцев

ГБУЗ НО "Городская клиническая больница № 30 Московского района", г. Нижний Новгород

Автор, ответственный за переписку.
Email: maks-bagryancev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2230-9431
SPIN-код: 5557-6327

врач-хирург 2 хирургического отделения

Россия, 603157, Россия, г. Нижний Новгород, ул. Березовская, 85а

Илья Викторович Павленко

ГБУЗ НО "Городская клиническая больница № 30 Московского района", г. Нижний Новгород

Email: maks-bagryancev@mail.ru

врач-ординатор 2 хирургического отделения

Россия, 603157, Россия, г. Нижний Новгород, ул. Березовская, 85а

Наталья Александровна Щелчкова

ЦНИЛ ГБОУ ВПО НижГМА МинЗдрава РФ, г. Нижний Новгород, Россия

Email: maks-bagryancev@mail.ru

кандидат биологических наук, заведующий отделом молекулярно-клеточных технологий

Россия, 603104, Россия, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, д. 70

Андрей Александрович Миронов

ФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»; ЦНИЛ ГБОУ ВПО НижГМА МинЗдрава РФ

Email: maks-bagryancev@mail.ru

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела экспериментального моделирования; доцент кафедры нейротехнологий Института биологии и биомедицины

Россия, 603022, Россия, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, д. 23; 603104, Россия, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, д. 70

Максим Георгиевич Рябков

ГБУЗ НО "Городская клиническая больница № 30 Московского района", г. Нижний Новгород

Email: maks-bagryancev@mail.ru

доктор медицинских наук, научный консультант 1 хирургического отделения

Россия, 603157, Россия, г. Нижний Новгород, ул. Березовская, 85а

Владимир Викторович Бесчастнов

ГБУЗ НО "Городская клиническая больница № 30 Московского района", г. Нижний Новгород

Email: maks-bagryancev@mail.ru

доктор медицинских наук, научный консультант 2 хирургического отделения

Россия, 603157, Россия, г. Нижний Новгород, ул. Березовская, 85а

Список литературы

Дополнительные файлы