The Wistar rats' line hemostatic system characteristics to be important for experimental surgery.

Aleksandr Anatol`yevich Kinzerskiy; Кинзерский Александр Анатольевич; Vladimir Ternt`evich Dolgikh; Долгих Владимир Терентьевич; Mikhail Sergeevich Korzhuk; Коржук Михаил Сергеевич; Darya Andreevna Kinzerskaya; Кинзерская Дарья Андреевна; Valeriya Evgenievna Zaytseva; Зайцева Валерия Евгеньевна

doi:10.18499/2070-478X-2018-11-2-126-133

Особенности системы гемостаза крысы линии Wistar, важные для экспериментальной хирургии.

Авторы: Кинзерский А.А.¹, Долгих В.Т.¹, Коржук М.С.¹, Кинзерская Д.А.¹, Зайцева В.Е.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО Омский государственный медицинский университет Минздрава России
Выпуск: Том 11, № 2 (2018)
Страницы: 126-133
Раздел: Оригинальные статьи
URL: https://vestnik-surgery.com/journal/article/view/1135
DOI: https://doi.org/10.18499/2070-478X-2018-11-2-126-133
ID: 1135

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Апробация новой методики гемостаза в хирургии зачастую проходит через этап эксперимента. Ключевым моментом является выбор животного и правомочность экстраполяции полученных экспериментальных результатов относительно человека. Лабораторные крысы часто используются для исследования параметров системы гемостаза при моделировании различной патологии в хирургии. Появление методики низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ) в совокупности с показателями коагулограммы, общего анализа крови, протеина С и плазминогена способно детализировать имеющиеся знания о своеобразии системы гемостаза у этих животных и помочь избежать ошибок в интерпретации полученных результатов в эксперименте.

Цель исследования. Выявить особенности параметров системы гемостаза крысы линии Wistar в сравнении с аналогичными параметрами системы гемостаза человека, важные для экспериментальной хирургии.

Материалы и методы. Исследование проведено на крысах‑самцах (n=32) линии Wistar массой 349±33 г (M±σ). Кровь забирали из левой сонной артерии в условиях наркоза тилетамином/золазепамом (20‑40 мг/кг внутримышечно) + ксилазином (5-10 мг/кг внутримышечно). Кровь без цитрата в объеме 0,45 мл за 8 секунд помещалась в кювету НПТЭГ АРП-01М «Меднорд», в настройках которого использовали дельту для принятия точки максимальной, равную 1, и время ожидания подъема кривой - 20 минут. Следующая порция крови набиралась в пробирку с 3,8% цитратом в объеме 4,5 мл (9:1) для исследования уровня фибриногена на полуавтоматическом коагулометре Thrombotimer 4 Behnk Elektronik, значений активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ), тромбинового времени (ТВ) и антитромбина III (AT III) ‑ на автоматическом анализаторе коагуляции крови Sysmex CA 600, активности плазминогена и протеина С - на полуавтоматическом фотометре Riele 5010 v5+ с длиной волны, равной 405 нм. Исследование показателя гематокрита и определение количества тромбоцитов выполняли на автоматическом гематологическом анализаторе ABX Micros ES 60. Для определения показателей системы гемостаза использовали реактивы ООО фирмы «Технология‑Стандарт». Параметры НПТЭГ для человека взят из цитируемой литературы, остальные показатели получены у 120 здоровых взрослых добровольцев. Статистическая обработка реализована на языке программирования R с использованием статистических пакетов “VIM”, “mice”, “car”, “sm”, “coin”, “boot”. Референсные значения НПТЭГ у крыс уточнены методом непараметрического бутстрепа. Сравнение между группами выполнено тестом Манна‑Уитни и перепроверено пермутационным тестом с коррекцией уровня p на множественные сравнения методом Беньямини‑Йекутили. Уровень α после коррекции принят, равный 0,05.

Результаты и их обсуждение. Большинство показателей системы гемостаза крысы отличаются от одноименных параметров человека, кроме показателя гематокрита (p₃=0,84, p₄=0,98) и показателя интенсивности лизиса и ретракции сгустка (ИРЛС) (p₃=0,15, p₄=0,067). У крысы по сравнению с человеком на фоне снижения активности протеина С на 29%, увеличения количества тромбоцитов и их активности на 69% и на 79%, роста активности тромбина и ускорения его образования на 35% и 30%, усилена I-II фаза коагуляции. В III фазу коагуляции отмечается усиление протеолитического этапа на 37% и ослабление полимеризационного на 44%. Укорачивается время свертывания на 29% и удлиняется тромбиновое время на 64%, что не противоречит росту коэффициента суммарной противосвертывающей активности крови (КСПА) на 62%. Другие показатели клинически значимо не отличаются.

Заключение. Система гемостаза крыс линии Wistar очень близка к человеческой за исключением значительного усиления I-II фазы свертывания, протеолитического этапа III фазы и такого же значительного ослабления ее полимеризационного этапа, возможно, за счет увеличения активности системы плазмина, антикоагулянтной активности крови на этом этапе и снижения уровня фибриногена. Эволюционно крысы лучше приспособлены к остановке кровотечения после травмы, что необходимо учитывать при выполнении эксперимента в хирургии.

Ключевые слова

крысы-самцы Wistar, система гемостаза, низкочастотная пьезотромбоэластография, коагулограмма, протеин С, плазминоген.

Полный текст

Эксперимент - неотъемлемая часть разработки и апробация новой методики гемостаза в хирургии. Ключевым моментом является выбор вида животного и правомочность экстраполяции полученных экспериментальных результатов относительно человека [1, 2]. Лабораторные крысы часто используются для исследования системы гемостаза при моделировании геморрагического, травматического шока, травмыпаренхиматозных органов ипроверки новых методов остановки кровотечения [2, 3, 4, 5, 6, 7]. Появление методики низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ) и использование полученных с ее помощью данных, в совокупности с показателями коагулограммы, общего анализа крови, протеина С и плазминогена способно детализировать имеющиеся знания о системе гемостаза у этих животныхи помочь избежать ошибок в интерпретации полученных результатов в эксперименте.
Цель исследования выявить особенности параметров системы гемостаза крысы линии Wistar в сравнении с аналогичными параметрами системы гемостаза человека, важные для экспериментальной хирургии.
Материалы и методы
Исследование проведено на крысах-самцах (n=42) линии Wistar массой 349±33 г (M±σ). Кровь забирали из левой сонной артерии  в условиях наркоза  тилетамином/золазепамом  (20‑40 мг/кг внутримышечно) + ксилазином (5-10 мг/кг внутримышечно). Эксперименты с животными проводились в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (86/609/EEC; 1986) и Всемирного общества защиты животных (WSPA). Кровь без цитрата в объеме 0,45 мл за 8 секунд помещалась в кювету низкочастотного пьезотромбоэластографа АРП-01М «Меднорд» (НПТЭГ), в настройках которого использовали дельту для принятия точки максимальной, равную 1, и время ожидания подъема кривой - 20 минут [8].
Исследовались величины: время контактной коагуляции (T1) в минутах (мин.), интенсивность контактной коагуляции (ИКК) в относительных единицах (о.е.), время достижения константы тромбиновой активности (T2, мин.), константа тромбиновой активности (КТА, о.е.), время свертывания крови (T3, мин.), интенсивность коагуляционного  драйва (ИКД, о.е.), интенсивность полимеризации сгустка (ИПС, о.е.), время формирования фибрин-тромбоцитарной структуры (T5, мин.), максимальная плотность сгустка (МА, о.е.), интенсивность тотального свертывания крови (ИТС, о.е.), интенсивность ретракции и лизиса сгустка (ИРЛС, %), коэффициент суммарной противосвертывающей активности (КСПА, о.е.). Следующая порция крови набиралась в пробирку с 3,8% цитратом в объеме 4,5 мл (9:1) для исследования уровня фибриногена на полуавтоматическом коагулометре Thrombotimer 4 Behnk Elektronik, значения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ), тромбинового времени (ТВ) и антитромбина III (АТ III) ‑ на автоматическом анализаторе коагуляции крови Sysmex CA 600, активности плазминогена и протеина С - на полуавтоматическом фотометре Riele5010 v5+с использованием длины волны, равной 405 нм. В пробирку с ЭДТА помещали 0,2 мл крови для исследования показателя гематокрита и количества тромбоцитов в общем анализе крови на автоматическом гематологическом анализаторе ABX Micros ES 60 [9, 10].
Для определения показателей системы гемостаза использовали реактивы ООО фирмы «Технология-Стандарт». Значения показателей низкочастотной пьезотромбоэластографии для человека взяты из цитируемой литературы [11], остальные параметры определены у 120 здоровых добровольцев в лаборатории клинической коагулогии БУЗОО «Областной детской клинической больницы». Статистическая обработка выполнена на языке программирования R с использованием статистических пакетов “VIM”, “mice”, “car”,  “sm”,  “coin”, “boot”. Выбросы исключены методом Тьюки: [Q1–1,5*IQR, Q3+1,5*IQR], где Q1, Q3 — границы первого и третьего квартилей, IQR=Q3–Q1 — межквартильный размах. Пробелы показателей были заполнены с помощью многомерного восстановления данных связанными уравнениями, используя пакеты “VIM” и “mice”. Оценка правильности распределениявыполнена по критерию Шапиро-Уилка, квантильными графиками методом огибающих Б. Рипли и графиками ядерной плотности, реализованных в пакетах “car”, “sm”.
Для всех показателей НПТЭГ у крыс были определены медиана (Me), среднее (М), среднеквадратичное отклонение (SD), первый и третий квартиль (Q1, Q3), максимальные (max) и минимальные значения (min). Кроме того, значения медианы (Me(b)), среднего (М(b)), среднеквадратичного отклонения (SD(b)) и 95% доверительные интервалы для них (95% CI) были уточнены методом непараметрического бутстрепа с коррекцией смещения и ускорением (ВСа) на основании 5000 псевдовыборок с использованием пакета  ”boot”.
Сравнение с показателями человека выполнено непараметрическим тестом Манна‑Уитни и, воизбежание недостаточной мощности выборки, перепроверено пермутационным тестом на основании 10000 псевдовыборок с помощью пакета  “coin”.
Коррекция уровня p  на одновременные множественные сравнения произведена методом Беньямини‑Йекутили, после чего уровень  α принят, равный 0,05.
Результаты и их обсуждение
Результаты по оценке основных статистик НПТЭГ у крыс представлены в табл. 1. Такие показатели как ИКК, Т1, КТА, Т3, Т5, ИПС, ИРЛС оказались по критерию Шапиро-Уилка неправильно распределенными. Однако после графической проверки методом огибающих Б. Рипли и графиками ядерной плотности неправильность распределения была подтверждена только у показателя ИРЛС (рис. 1). Учитывая характер представленных в литературе данных и неоднородность показателей по нормальности распределения, было сочтено целесообразным использование непараметрических критериев, таких как тест Манна-Уитни и пермутационный тест [12] с коррекцией уровня р на множественные сравнения методом Беньямини-Йекутили.
После проведенной статистической обработки, как видно из табл. 2 и табл. 3, можно сказать, что крысы отличаются от людей по всем перечисленным параметрам, кроме показателя гематокрита (p3=0,84, p4=0,98) и ИРЛС (p3=0,15, p4=0,067), характеризующего фибринолитическую активность крови. Ряд интегративных параметров, несмотря на статистическую значимость различий у крыс и людей, клинически не значимо отличается: это показатели ИТС (Me=17,0 и 15,6 о.е), T1 (Me=0,7 и 0,9 мин.), АЧТВ (Me=32,0 и 34,86 c), ПВ (Me= 14,2 и 12,55 с) - или отличаются не выраженно: Т5 (Me=26,8 и 34,0 мин.), активность антитромбина III (Me=97,95 и 111,26 %), и плазминогена (Me=90,5 и 108,35 %), количество фибриногена (Me=2,0 и 2,62 г/л) и МА (Me=462 и 502,5 о.е)
Это указывает на сбалансированность ключевых компонентов системы гемостаза при сопоставлении показателей, присущих человеку и крысе, а также на схожесть конечного результата свертывания. Тем не менее, есть резко отличающие показатели, такие какколичество тромбоцитов (Me=830 и 259*109/л), ИКК (Me=-5,71 и -27,25 о.е.), Т2 (Me=2,8 и 4,0 мин.), КТА (Me=45,45 и 29,4 о.е), ИКД (Me=59,88 и 37,6 о.е), Т3 (Me=5,4 и 7,6 мин.), ИПС (Me=9,3 и 16,75 о.е.), КСПА (Me=6,26 и 2,35 о.е), активность протеина С (Me=79,5 и 111,38 %), ТВ (Me=52,7 и 19,09 с).
Анализируя эти отличия, можно сделать следующие выводы. У крысы, по сравнению с человеком, на фоне снижения активности протеина С на 29%, увеличения количества тромбоцитов и их активности на 69% и на 79%, роста активности тромбина и ускоренияего образования на 35% и 30%, усилена I-II фаза коагуляции (этап предварительно зарождающегося сгустка). В третью фазу коагуляции отмечается усиление протеолитического этапа на 37% и ослабление полимеризационного на 44%. Как следствие, фиксируется ускорение перехода крови из состояния золя в гель, т.е. достижения точки желирования, и укорочения времени свертывания на 29%. У крысы удлиняется ТВ на 64%,что не противоречит росту коэффициента суммарной антикоагулянтной активности крови (КСПА) на 62%. В целом, сложившаяся картина свидетельствует о том, что у этих экспериментальных животных тромбообразование инициируется раньше, чем у человека, и нарастает быстрее до этапа полимеризации фибрин-мономеров, который у них значительно замедлен. Дальше происходит небольшое ускорение латеральной сборки фибрин-полимера, и формируется тромб, уступающий немного по плотности, но не по интенсивности лизиса. Все это реализуется на фоне снижения активности антикоагулянтов, таких как антитромбин III, протеин С, на протеолитическом этапе свертывания и усиления действия других антикоагулянтов и системы плазмина на этапе полимеризации. Одной из особенностей проведенного исследования является то, что выполнялась оценка артериальной крови у крысы, однако такие интегративные клоттинговые показатели, как АЧТВ, ПВ, ТВ, уровни активности антитромбина и количество фибриногена оказались приближенные к аналогичным уровням в венозной крови [13].
Кроме того, забор венозной крови без консерванта за 8-10 секунд у мелкого лабораторного животного (крыса или мышь) для выполнения НПТЭГ мало возможен без искажения показателей, в виду необходимости изъятия большого объема крови за короткий промежуток времени, от 0,5-1 мл, и склонности к более раннему началу свертывания у грызунов [14]. По данным литературы получены схожие результаты методикой тромбоэластографии (ТЭГ) у крысы человека при исследовании артериальных образцов с цитратом натрия из бедренной артерии [14]. Исследование и сравнение функции тромбоцитов импедансной агрегатометрией и показателей ротационной тромбоэластометрии (РОТЭМ) в венозной и артериальной крови у человека показали отсутствие клинически значимых отличий, не смотря на их статистическую значимость [15]. Сходные результаты получены методикой ТЭГ, когда отмечалась тенденция в артериальной крови к более быстрому и сильному свертыванию, без отличий по лизису сгустка [16].
Как видно из таблицы 2 медиана показателя ТВ (Me=52,7 и 19,09 c) на 64% больше у крысы. По данным Lewis J.H. и соавт., это результат присутствия в плазме крыс особого ингибитора тромбина [17], и как было показано другими авторами сильно зависит отвида используемого тромбина и типа коагулометра [18, 19]. Полученные значения тромбинового времени могут не отличаться от человеческих или быть в разной степени больше его [13, 17, 18, 19]. Таким образом, НПТЭГ вносит определенную ясность в это противоречие, рассматривая этап преобразования фибриногена в фибрин и его полимеризацию в цельной крови без использования стимулятора и ингибиторов свертывания, таких как тромбин и цитрат натрия.
Перечисленные выше особенности следует учитывать при планировании и проведении эксперимента с использованием в качестве лабораторных животных крыс линии Wistar. Например, гипотетическое исследование, направленное на проверку нового гемостатического агента, в котором моделируется травма паренхиматозного органа (печени, селезенки), может закончиться ложноположительными результатами в виду того, что кровотечение у крыс склонно останавливаться самостоятельно в течение первых 6 минут [6] за счет повышенного тромбогенного потенциала. С другой стороны, по тем же причинам может быть облегчено моделирование контролируемого геморрагического [7], травматического шока с посттравматической коагулопатией и их исходом в полиорганную недостаточность [1, 2, 3, 5].
Использование современных инструментов для оценки системы гемостаза, таких как НПТЭГ, наряду со стандартными клоттинговыми тестами позволяет учесть особенности этой системы у экспериментального животного и детально охарактеризовать каждый этап свертывания в норме и при патологии, а также экстраполировать полученные результаты на человека.
Заключение
Система гемостаза лабораторных крыс линии Wistar, изученная с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии, стандартных клоттинговых тестов и основных компонентов антикоагулянтной и фибринолитической системы, в целом не отличается от системы гемостаза у человека, за исключением значительного усиления I-II фаз свертывания, протеолитического этапа III фазы и такого же значительного ослабления ее полимеризационного этапа, возможно, за счет увеличения активности системы плазмина, антикоагулянтной активности крови на этом этапе и снижения уровня фибриногена. Эволюционно, учитывая необходимость постоянно бороться в популяции за пищу и возможность размножения, и тем самым неизбежно получать увечья, такие особенности можно считать оправданными, потому что лучше раньше образованный «плохой» тромб, чем позже «хороший». Полученные знания следует учитывать при планировании и проведении эксперимента для адекватной трактовки результатов.