The Wistar rats' line hemostatic system characteristics to be important for experimental surgery.

Aleksandr Anatol`yevich Kinzerskiy; Кинзерский Александр Анатольевич; Vladimir Ternt`evich Dolgikh; Долгих Владимир Терентьевич; Mikhail Sergeevich Korzhuk; Коржук Михаил Сергеевич; Darya Andreevna Kinzerskaya; Кинзерская Дарья Андреевна; Valeriya Evgenievna Zaytseva; Зайцева Валерия Евгеньевна

doi:10.18499/2070-478X-2018-11-2-126-133

The Wistar rats' line hemostatic system characteristics to be important for experimental surgery.

Authors: Kinzerskiy A.A.¹, Dolgikh V.T.¹, Korzhuk M.S.¹, Kinzerskaya D.A.¹, Zaytseva V.E.¹
Affiliations:
1. The FSFEI of HE Omsk State Medical University of the Russian Federation Ministry for Public Health
Issue: Vol 11, No 2 (2018)
Pages: 126-133
Section: Original articles
URL: https://vestnik-surgery.com/journal/article/view/1135
DOI: https://doi.org/10.18499/2070-478X-2018-11-2-126-133
ID: 1135

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Background. Testing a new method of hemostasis in surgery often goes through the experimental stage. The key point is selecting animals, and eligibility of the obtained experimental results extrapolating to humans. Experimental rats are often used for studying the hemostasis system indicates in modeling various pathologies in surgery. The emergence of the low-frequency piezothromboelastography technique in combination with the coagulogram findings, general blood test, protein C and plasminogen indicators has been able to detail the available knowledge about the hemostasis system at these animals and to help avoiding errors in interpreting the results obtained in the experiment.

Aim. To determine the features of the Wistar line rats’ hemostasis system parameters in comparison with the same human ones being important for experimental surgery.

Materials and methods. The research was conducted on Wistar male rats (n=32) weighing 349 ±33 g (M±σ). Blood was taken from the left carotid artery under conditions of anesthesia with tiletamine / zolazepam (20-40 mg / kg intramuscularly) + xylazine (5-10 mg / kg intramuscularly). Eight seconds before blood without citrate in a volume of 0.45 ml was placed in a cuvette of the LFPTEG technique ARP-01M “Mednord” in settings of which the delta was used to take a maximum point equal to 1, and the waiting time of the curve rising was 20 minutes. The next blood sample was collected in a test tube with 3.8% citrate in a volume of 4.5 ml (9:1) for investigating the fibrinogen level at the Thrombotimer 4 Behnk Elektronik semi-automatic coagulometer, the activated partial thromboplastin time (APTT) values, prothrombin time (PT), thrombin time (TT) and antithrombin III at the automatic blood coagulation analyzer Sysmex CA 600, and activity of plasminogen and protein C at the semi-automatic Riele 5010 v5 + photometer with a wave length of 405 nm. Studying the hematocrit indicators and determining the platelet count were performed at the automatic hematological analyzer ABX Micros ES 60. The reagents of Ltd "Tekhnologiya standart" were used for detecting the parameters of the hemostasis system. Parameters of the LFPTEG technique for human had been taken from the cited literature, the other indicators had been obtained from 120 healthy adult volunteers. Statistical processing was implemented in the programming language R with using the statistical packages “VIM”, “mice”, “car”, “sm”, “coin”, “boot”. The LFPTEG technique reference values in rats were refined by the nonparametric bootstrap method. The comparison between the groups was carried out by Mann- Whitney's test and rechecked by the Permutation test with the level p correction for multiple comparisons by the Benjamin-Yekutili method. The α level was assumed to be 0.05 after correction.

Results and Discussion. Most indicators of the rat hemostasis system differed from the same human parameters, except the hematocrit (p3=0.84, p4=0.98) indicator, and the lysis intensity, and retraction of the clot (p3=0.15, p4=0.067) indices. The I-II coagulation phases were increased at the background of decreasing protein C activity by 29%, increasing the number of platelets and their activity by 69% and 79%, intensification of thrombin activity and acceleration of its formation by 35% and 30% in a rat compared to a person. At the III phase of coagulation the proteolytic stage was noted to become intensified by 37% and the polymerization to become weakened by 44%. The clotting time was shortened by 29%, and the thrombin time was prolonged by 64% that did not contradict the coefficient growth of total anticoagulant blood activity (TAAC) by 62%. Other indicators have clinically differed a little.

Conclusion. The Wistar line rats’ haemostasis system is very similar to human one except significant increasing of the I-II coagulation phases, the III proteolytic phase, and significant weakening of its polymerization stage probably due to increasing the plasmin system activity, the anticoagulant blood activity at this stage, and decreasing the fibrinogen level. Rats evolutionarily must be considered to be better suited to stop bleeding after trauma while performing a surgical experiment.

Keywords

Wistar line male rats, hemostasis system, low-frequency piezotromboelastography, coagulogram, protein C, plasminogen.

Full Text

Эксперимент - неотъемлемая часть разработки и апробация новой методики гемостаза в хирургии. Ключевым моментом является выбор вида животного и правомочность экстраполяции полученных экспериментальных результатов относительно человека [1, 2]. Лабораторные крысы часто используются для исследования системы гемостаза при моделировании геморрагического, травматического шока, травмыпаренхиматозных органов ипроверки новых методов остановки кровотечения [2, 3, 4, 5, 6, 7]. Появление методики низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ) и использование полученных с ее помощью данных, в совокупности с показателями коагулограммы, общего анализа крови, протеина С и плазминогена способно детализировать имеющиеся знания о системе гемостаза у этих животныхи помочь избежать ошибок в интерпретации полученных результатов в эксперименте.
Цель исследования выявить особенности параметров системы гемостаза крысы линии Wistar в сравнении с аналогичными параметрами системы гемостаза человека, важные для экспериментальной хирургии.
Материалы и методы
Исследование проведено на крысах-самцах (n=42) линии Wistar массой 349±33 г (M±σ). Кровь забирали из левой сонной артерии  в условиях наркоза  тилетамином/золазепамом  (20‑40 мг/кг внутримышечно) + ксилазином (5-10 мг/кг внутримышечно). Эксперименты с животными проводились в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (86/609/EEC; 1986) и Всемирного общества защиты животных (WSPA). Кровь без цитрата в объеме 0,45 мл за 8 секунд помещалась в кювету низкочастотного пьезотромбоэластографа АРП-01М «Меднорд» (НПТЭГ), в настройках которого использовали дельту для принятия точки максимальной, равную 1, и время ожидания подъема кривой - 20 минут [8].
Исследовались величины: время контактной коагуляции (T1) в минутах (мин.), интенсивность контактной коагуляции (ИКК) в относительных единицах (о.е.), время достижения константы тромбиновой активности (T2, мин.), константа тромбиновой активности (КТА, о.е.), время свертывания крови (T3, мин.), интенсивность коагуляционного  драйва (ИКД, о.е.), интенсивность полимеризации сгустка (ИПС, о.е.), время формирования фибрин-тромбоцитарной структуры (T5, мин.), максимальная плотность сгустка (МА, о.е.), интенсивность тотального свертывания крови (ИТС, о.е.), интенсивность ретракции и лизиса сгустка (ИРЛС, %), коэффициент суммарной противосвертывающей активности (КСПА, о.е.). Следующая порция крови набиралась в пробирку с 3,8% цитратом в объеме 4,5 мл (9:1) для исследования уровня фибриногена на полуавтоматическом коагулометре Thrombotimer 4 Behnk Elektronik, значения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ), тромбинового времени (ТВ) и антитромбина III (АТ III) ‑ на автоматическом анализаторе коагуляции крови Sysmex CA 600, активности плазминогена и протеина С - на полуавтоматическом фотометре Riele5010 v5+с использованием длины волны, равной 405 нм. В пробирку с ЭДТА помещали 0,2 мл крови для исследования показателя гематокрита и количества тромбоцитов в общем анализе крови на автоматическом гематологическом анализаторе ABX Micros ES 60 [9, 10].
Для определения показателей системы гемостаза использовали реактивы ООО фирмы «Технология-Стандарт». Значения показателей низкочастотной пьезотромбоэластографии для человека взяты из цитируемой литературы [11], остальные параметры определены у 120 здоровых добровольцев в лаборатории клинической коагулогии БУЗОО «Областной детской клинической больницы». Статистическая обработка выполнена на языке программирования R с использованием статистических пакетов “VIM”, “mice”, “car”,  “sm”,  “coin”, “boot”. Выбросы исключены методом Тьюки: [Q1–1,5*IQR, Q3+1,5*IQR], где Q1, Q3 — границы первого и третьего квартилей, IQR=Q3–Q1 — межквартильный размах. Пробелы показателей были заполнены с помощью многомерного восстановления данных связанными уравнениями, используя пакеты “VIM” и “mice”. Оценка правильности распределениявыполнена по критерию Шапиро-Уилка, квантильными графиками методом огибающих Б. Рипли и графиками ядерной плотности, реализованных в пакетах “car”, “sm”.
Для всех показателей НПТЭГ у крыс были определены медиана (Me), среднее (М), среднеквадратичное отклонение (SD), первый и третий квартиль (Q1, Q3), максимальные (max) и минимальные значения (min). Кроме того, значения медианы (Me(b)), среднего (М(b)), среднеквадратичного отклонения (SD(b)) и 95% доверительные интервалы для них (95% CI) были уточнены методом непараметрического бутстрепа с коррекцией смещения и ускорением (ВСа) на основании 5000 псевдовыборок с использованием пакета  ”boot”.
Сравнение с показателями человека выполнено непараметрическим тестом Манна‑Уитни и, воизбежание недостаточной мощности выборки, перепроверено пермутационным тестом на основании 10000 псевдовыборок с помощью пакета  “coin”.
Коррекция уровня p  на одновременные множественные сравнения произведена методом Беньямини‑Йекутили, после чего уровень  α принят, равный 0,05.
Результаты и их обсуждение
Результаты по оценке основных статистик НПТЭГ у крыс представлены в табл. 1. Такие показатели как ИКК, Т1, КТА, Т3, Т5, ИПС, ИРЛС оказались по критерию Шапиро-Уилка неправильно распределенными. Однако после графической проверки методом огибающих Б. Рипли и графиками ядерной плотности неправильность распределения была подтверждена только у показателя ИРЛС (рис. 1). Учитывая характер представленных в литературе данных и неоднородность показателей по нормальности распределения, было сочтено целесообразным использование непараметрических критериев, таких как тест Манна-Уитни и пермутационный тест [12] с коррекцией уровня р на множественные сравнения методом Беньямини-Йекутили.
После проведенной статистической обработки, как видно из табл. 2 и табл. 3, можно сказать, что крысы отличаются от людей по всем перечисленным параметрам, кроме показателя гематокрита (p3=0,84, p4=0,98) и ИРЛС (p3=0,15, p4=0,067), характеризующего фибринолитическую активность крови. Ряд интегративных параметров, несмотря на статистическую значимость различий у крыс и людей, клинически не значимо отличается: это показатели ИТС (Me=17,0 и 15,6 о.е), T1 (Me=0,7 и 0,9 мин.), АЧТВ (Me=32,0 и 34,86 c), ПВ (Me= 14,2 и 12,55 с) - или отличаются не выраженно: Т5 (Me=26,8 и 34,0 мин.), активность антитромбина III (Me=97,95 и 111,26 %), и плазминогена (Me=90,5 и 108,35 %), количество фибриногена (Me=2,0 и 2,62 г/л) и МА (Me=462 и 502,5 о.е)
Это указывает на сбалансированность ключевых компонентов системы гемостаза при сопоставлении показателей, присущих человеку и крысе, а также на схожесть конечного результата свертывания. Тем не менее, есть резко отличающие показатели, такие какколичество тромбоцитов (Me=830 и 259*109/л), ИКК (Me=-5,71 и -27,25 о.е.), Т2 (Me=2,8 и 4,0 мин.), КТА (Me=45,45 и 29,4 о.е), ИКД (Me=59,88 и 37,6 о.е), Т3 (Me=5,4 и 7,6 мин.), ИПС (Me=9,3 и 16,75 о.е.), КСПА (Me=6,26 и 2,35 о.е), активность протеина С (Me=79,5 и 111,38 %), ТВ (Me=52,7 и 19,09 с).
Анализируя эти отличия, можно сделать следующие выводы. У крысы, по сравнению с человеком, на фоне снижения активности протеина С на 29%, увеличения количества тромбоцитов и их активности на 69% и на 79%, роста активности тромбина и ускоренияего образования на 35% и 30%, усилена I-II фаза коагуляции (этап предварительно зарождающегося сгустка). В третью фазу коагуляции отмечается усиление протеолитического этапа на 37% и ослабление полимеризационного на 44%. Как следствие, фиксируется ускорение перехода крови из состояния золя в гель, т.е. достижения точки желирования, и укорочения времени свертывания на 29%. У крысы удлиняется ТВ на 64%,что не противоречит росту коэффициента суммарной антикоагулянтной активности крови (КСПА) на 62%. В целом, сложившаяся картина свидетельствует о том, что у этих экспериментальных животных тромбообразование инициируется раньше, чем у человека, и нарастает быстрее до этапа полимеризации фибрин-мономеров, который у них значительно замедлен. Дальше происходит небольшое ускорение латеральной сборки фибрин-полимера, и формируется тромб, уступающий немного по плотности, но не по интенсивности лизиса. Все это реализуется на фоне снижения активности антикоагулянтов, таких как антитромбин III, протеин С, на протеолитическом этапе свертывания и усиления действия других антикоагулянтов и системы плазмина на этапе полимеризации. Одной из особенностей проведенного исследования является то, что выполнялась оценка артериальной крови у крысы, однако такие интегративные клоттинговые показатели, как АЧТВ, ПВ, ТВ, уровни активности антитромбина и количество фибриногена оказались приближенные к аналогичным уровням в венозной крови [13].
Кроме того, забор венозной крови без консерванта за 8-10 секунд у мелкого лабораторного животного (крыса или мышь) для выполнения НПТЭГ мало возможен без искажения показателей, в виду необходимости изъятия большого объема крови за короткий промежуток времени, от 0,5-1 мл, и склонности к более раннему началу свертывания у грызунов [14]. По данным литературы получены схожие результаты методикой тромбоэластографии (ТЭГ) у крысы человека при исследовании артериальных образцов с цитратом натрия из бедренной артерии [14]. Исследование и сравнение функции тромбоцитов импедансной агрегатометрией и показателей ротационной тромбоэластометрии (РОТЭМ) в венозной и артериальной крови у человека показали отсутствие клинически значимых отличий, не смотря на их статистическую значимость [15]. Сходные результаты получены методикой ТЭГ, когда отмечалась тенденция в артериальной крови к более быстрому и сильному свертыванию, без отличий по лизису сгустка [16].
Как видно из таблицы 2 медиана показателя ТВ (Me=52,7 и 19,09 c) на 64% больше у крысы. По данным Lewis J.H. и соавт., это результат присутствия в плазме крыс особого ингибитора тромбина [17], и как было показано другими авторами сильно зависит отвида используемого тромбина и типа коагулометра [18, 19]. Полученные значения тромбинового времени могут не отличаться от человеческих или быть в разной степени больше его [13, 17, 18, 19]. Таким образом, НПТЭГ вносит определенную ясность в это противоречие, рассматривая этап преобразования фибриногена в фибрин и его полимеризацию в цельной крови без использования стимулятора и ингибиторов свертывания, таких как тромбин и цитрат натрия.
Перечисленные выше особенности следует учитывать при планировании и проведении эксперимента с использованием в качестве лабораторных животных крыс линии Wistar. Например, гипотетическое исследование, направленное на проверку нового гемостатического агента, в котором моделируется травма паренхиматозного органа (печени, селезенки), может закончиться ложноположительными результатами в виду того, что кровотечение у крыс склонно останавливаться самостоятельно в течение первых 6 минут [6] за счет повышенного тромбогенного потенциала. С другой стороны, по тем же причинам может быть облегчено моделирование контролируемого геморрагического [7], травматического шока с посттравматической коагулопатией и их исходом в полиорганную недостаточность [1, 2, 3, 5].
Использование современных инструментов для оценки системы гемостаза, таких как НПТЭГ, наряду со стандартными клоттинговыми тестами позволяет учесть особенности этой системы у экспериментального животного и детально охарактеризовать каждый этап свертывания в норме и при патологии, а также экстраполировать полученные результаты на человека.
Заключение
Система гемостаза лабораторных крыс линии Wistar, изученная с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии, стандартных клоттинговых тестов и основных компонентов антикоагулянтной и фибринолитической системы, в целом не отличается от системы гемостаза у человека, за исключением значительного усиления I-II фаз свертывания, протеолитического этапа III фазы и такого же значительного ослабления ее полимеризационного этапа, возможно, за счет увеличения активности системы плазмина, антикоагулянтной активности крови на этом этапе и снижения уровня фибриногена. Эволюционно, учитывая необходимость постоянно бороться в популяции за пищу и возможность размножения, и тем самым неизбежно получать увечья, такие особенности можно считать оправданными, потому что лучше раньше образованный «плохой» тромб, чем позже «хороший». Полученные знания следует учитывать при планировании и проведении эксперимента для адекватной трактовки результатов.

About the authors