Возможности и перспективы использования бактериофагов в лечении хронических ран мягких тканей

Полный текст

Серьёзной проблемой, в том числе экономической, стоящей перед системами здравоохранения всего мира, являются хронические раны мягких тканей [1]. Хронической считают рану, существующую более 4 недель без признаков активного заживления, исключение составляют обширные раневые дефекты с признаками активной репарации [2, 3]. На практике — это раны, не достигающие показателя уменьшения площади на 50 % к исходу 4-й недели лечения [4]. В России, наличие хронических ран мягких тканей зарегистрировано более чем у 2,5 млн. человек, у 70 % пациентов такие раны многократно рецидивируют и значительно снижают качество жизни, являясь причиной продолжительных госпитализаций и периодов нетрудоспособности, что наносит весомый ущерб психоэмоциональному фону пациента и его ближайшего окружения [5]. Одной из причин длительного существования раневого дефекта является хирургическая инфекция, вызванная антибиотикорезистентными возбудителями, часто в виде биопленки [6, 7]. Так, по данным J.F. Guest et al. (2018) до 68% всех хронических ран у пациентов с сахарным диабетом клинически инфицированы на момент первичного осмотра, и еще у 23% пациентов в среднем через 4 месяца после появления дефекта кожи развивается раневая инфекция. В дальнейшем, несмотря на применение повязок с антисептиками, у 14% пациентов в процессе лечения сохраняются клинические признаки инфекции [8]. Во многих работах была продемонстрирована прямая связь между бактериальной нагрузкой и активностью репаративных процессов в ране [9-11]. Сокращение бактериальной нагрузки до уровня, приемлемого для макроорганизма, а также устранение из раневого дефекта наиболее вирулентных форм патогенных микроорганизмов является одним из общепризнанных принципов лечения ран. Перспективным направлением развития терапии, направленной на борьбу с антибиотикорезистентными микроорганизмами, в том числе в хронических ранах, является фаготерапия. Бактериофаги нетоксичны, высокоспецифичны и оставляют нормальную микробиоту нетронутой, что, несомненно, делает их хорошим выбором для применения у пациентов с хроническими заболеваниями и длительно незаживающими ранами [12].

Целью представленного обзора явилась систематизация представленной в современной научной литературе информации о проблеме использования фаготерапии для лечения хронических ран мягких тканей. В результате из электронных баз данных научных библиотек, (NCBI, elibrary) по ключевым словам «бактериофаги», «фаготерапия», «хронические раны» было выбрано 58 источников научной литературы (оригинальные научные исследования и обзорные статьи), из которых мы выделили 46 публикаций, подходящих по тематике исследования (исключено 12 статей). Большинство источников, исключенных из результата поиска были связаны с сообщениями о фагах, используемых с диагностической целью для индикации видового и внутривидового дифференцирования бактерий; либо рассматривающие аспекты молекулярной биологии и генной инженерии, затрагивающие изучение генома ДНК фага; или исследования, не рассматривающие фаги в качестве возможности их практического клинического применения.

Особенностью фаготерапии является высокая специфичность бактериофагов по отношению к бактериям-мишеням [13]. Это означает, что для получения активности широкого спектра действия более целесообразно использовать смесь фагов [14]. В исследовании [15] фаговый коктейль использовался против вызванной K. pneumonia инфекции ожоговой раны. Была доказана его эффективность для купирования инфекционного процесса без какой-либо вероятности образования устойчивых мутантов штамма. При этом, хотя результаты монофаговой терапии были также положительными, но фаговый коктейль был более эффективен по следующим критериям: бактериальная нагрузка, сокращение раны, активность миелопероксидазы кожи, образование коллагена. Авторы считают, что по сравнению с любым отдельным фагом, коктейль фагов значительно более эффективен в отношении появления устойчивых мутантов, следовательно, этот подход может служить эффективной стратегией лечения раневой инфекции у пациентов, которые не отвечают на традиционную терапию антибиотиками. Результаты других экспериментальных исследований на животных подтверждают безопасность и эффективность фагов при лечении хронических ран, инфицированных S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii [16, 17]. В ряде экспериментальных исследований показано, что литические фаги способствуют снижению плотности бактерий при местном инфекционном процессе [18], а в некоторых случаях даже более эффективны, чем антибиотики в предотвращении смертности от этих инфекций [19].

Поскольку хронизация раневого процесса ассоциирована с наличием в ране биопленки, в частности известно, что образцы отделяемого, полученного с поверхности хронических ран мягких тканей и исследованного при помощи электронной микроскопии в 60% случаев содержали бактериальные биопленки, в то время как в образцах, полученных из свежих ран процент выявления биоплёнок, составил лишь 6% [20], активно исследуется вопрос о возможности использования бактериофагов для борьбы с биопленками. С этой целью исследователи центра биоинженерии Португалии [21] использовали модель ex vivo – кожный эксплант свиньи, на котором была смоделирована рана, инфицированная микроорганизмами способными образовывать биоплёнки. В эксперименте использовали биопленки сформированные монокультурами мультирезистентных штаммов A.baumannii, P. aeruginosa, P. mirabilis и E.coli. Спустя сутки биопленки подвергались обработке бактериофагами: в качестве монопрепарата и фаговым коктейлем, содержащим фаги, видоспецифичные по отношению к исследуемым патогенам. Использование бактериофагов привело к значительному снижению бактериальной обсемененности, что доказало эффективность применения фагов в отношении бактериальных агентов, расположенных в биопленках. По мнению авторов, эффективность фаготерапии в клинической практике будет усиливаться за счет иммунных реакций организма.

В работе [22] доказано, что фаготерапия эффективна против раневых инфекций, вызванных P. aeruginosa. Критериями эффективности в этой работе кроме количественного бактериологического анализа и исследования биопленки, послужили просвечивающая электронная микроскопия и гель-электрофорез в импульсном поле. Авторы констатировали что фаг явился причиной значительного сокращения популяции бактерий как в планктонных клетках, так и в биопленках.

Коллективом исследователей из США, Швеции и Великобритании доказана гипотеза, заключающаяся в том, что, учитывая биохимические и экологические характеристики бактериофагов, они могут уничтожать бактерии в биопленках, поскольку оказывают более эффективное бактерицидное воздействие, чем антибиотики, в частности, ферменты полисахарид-деполимеразы, продуцируемые фагами, способны разрушать внеклеточный матрикс биопленки [23]. Лизируя бактерии вне биопленок, литические фаги стимулируют размножение клеток внутри этой структуры, тем самым делают бактерии внутри биопленки более метаболически активными и, таким образом, более восприимчивыми к уничтожению антибиотиками [24].

            В экспериментальном исследовании на модели раны мыши [25] была выполнена оценка влияния бактериофагов на биопленку антибиотикорезистентной P. aeruginosa. Результаты показали, что коктейль фагов оказывает на биопленку ингибирующее действие и количество бактерий в ране после обработки бактериофагами значительно уменьшается. Этот эффект был подтвержден в экспериментальном исследовании ученых из США, выполненном на модели ожоговой раны на мышах [22].

Механизм действия бактериофагов на биопленку сводится к следующим положениям [26]:

1. Бактериофаги реплицируются в своих клетках-хозяевах, что приводит к локализованному увеличению количества фагов (амплификация). Это увеличивает их концентрацию в биопленке. Распространяясь и уничтожая бактерии, продуцирующие материал для восстановления биопленки, бактериофаги снижают потенциал ее регенерации.
2. Бактериофаги могут нести или экспрессировать деполимеризующие ферменты, которые разрушают внеклеточное полимерное вещество биопленки.
3. Бактериальные клетки-персистеры могут быть инфицированы бактериофагами, при этом, хотя бактериофаги не могут реплицироваться и уничтожать неактивные клетки, они могут оставаться внутри этих бактерий до тех пор, пока они не активируются, а затем не начнут продуктивную инфекцию, которая затем разрушает клетки.

Еще одной приоритетной проблемой, которую решают несколько исследовательских групп в странах Европы, Азии и США является создание и поддержание достаточной концентрации бактериофагов в зоне клинического интереса при лечении раневой инфекции. В совместном исследовании французских, бельгийских и швейцарских ученых [27], выполненном в рамках европейского проекта "PhagoBurn", сделан вывод, что низкие концентрации фагов в области раневого дефекта приводят к неудачным исходам лечения. В основе решения этой проблемы лежит идея создания «депо бактериофагов» но, как оказалось, это является сложной технической задачей ввиду крайне малых (до 100 нм) размеров бактериофагов и для решения этой проблемы предлагается осуществлять иммобилизацию фагов в структуре полимерных носителей, что позволяет увеличить период их активности на раневой поверхности [28]. Для изучения возможности иммобилизации бактериофагов в различных материалах, служащих основой для раневых покрытий, было выполнено исследование учеными из Египта [29]. Авторы сравнивали материалы на основе биосовместимых нановолокон в комплексе с медом, поливиниловым спиртом, хитозаном и бактериофагом. Зафиксировано, что бактериофаг проявлял сильную антибактериальную активность по отношению ко всем испытуемым бактериальным штаммам и вызывал почти полное уничтожение множественной лекарственной устойчивости P. aeruginosa. Испытание in vivo показало улучшение результатов заживления ран, а тестирование цитотоксичности доказало хорошую биосовместимость. Авторы делают вывод о перспективности разработки раневых покрытий, включающих в себя бактериофаги.

Для иммобилизации бактериофагов предлагается использовать «подручные» средства. В частности, А.Г. Орлов и А.Н. Липин [30] предлагают наносить раствор, содержащий бактериофаги на коллагеновую гемостатическую губку и в дальнейшем укрывать ею трансплантат. Ученые из Португалии [31] изучали возможность применения фагов в комбинации с каштановым медом для уничтожения биопленок бактерий P. aeruginosa и E. coli. По мнению авторов, комбинирование бактериофагов и меда приводит к более эффективному уничтожению биопленки из-за способности мёда повреждать мембрану бактериальной клетки и проникать в матрицу биопленки, способствуя и усиливая последующую фаговую инвазию. В результате доказано сохранение жизнеспособности фагов в меде в течение 24 часов, при этом отмечено, что основными свойствами меда, которые вызывают потерю жизнеспособности фага, являются его низкий рН (от 3,2 до 4,5) и осмотическая активность за счет высокого содержания сахара (около 80%). В этой работе авторы стремились определить, оказывали ли комбинированные препараты с фагом и медом антибактериальный результат. Тестирование синергизма не являлось основной целью этого исследования.

Перспективным представляется способ, предложенный отечественными исследователями [32], и обеспечивающий иммобилизацию бактериофагов в гидрогелевой повязке, создаваемой ex tempore, что позволяет оперативно выполнять подбор бактериофагов, специфичных для возбудителей раневой инфекции, у каждого конкретного пациента. По этому же пути пошли индийские врачи [33], разработавшие повязку для лечения ожоговых ран, где в качестве носителя комбинации бактериофагов и антибиотиков использовали гидрогель на основе поливинилового спирта.

Сочетание бактериофагов и антибиотиков является одним из возможных и весьма привлекательных вариантов антибактериальной терапии. В литературе представлены исследования, обосновывающие ограничения на использование фага в качестве единственного агента для лечения бактериальных инфекций [34, 35], с другой стороны, имеются обоснованные предположения, что бактериофаги могут быть эффективным дополнением к лечению антибиотиками [36-38]. Комбинированное использование фага и антибиотиков может привести к ряду результатов. Два агента могут действовать аддитивно, то есть сумма их индивидуальных эффектов равна их комбинаторной эффективности. Они также могут действовать синергетически: их общая эффективность больше, чем по отдельности. Третий результат - отсутствие эффекта из-за отсутствия действия каждого из агентов. Наконец, может возникнуть антагонизм, при котором действие одного из агентов каким-то образом мешает действию другого. Исследованиям изучения этого взаимодействия посвящены работы нескольких авторских коллективов в разных странах. P. aeruginosa часто служит непосредственной причиной летальности пациентов с ожогами и поэтому является особенно привлекательным кандидатом для комбинированной терапии фагом и антибиотиками [39]. Как известно, P. aeruginosa обладает природной устойчивостью ко многим антибиотикам, однако в природе существует множество фагов P. aeruginosa, которые могут уничтожать эти бактерии и которые могут быть выделены из различных источников, включая сточные воды [40, 41].

В работе Schooley RT et al. была продемонстрирована аддитивную активность in vitro между бактериофагами и субингибирующими концентрациями миноциклина при использовании в комбинации против устойчивого к бактериофагу изолята A. baumannii при лечении свищевой формы инфицированной постнекротической псевдокисты поджелудочной железы [42]. Аддитивная или синергетическая активность бактериофагов и традиционных антибиотиков при лечении местной раневой инфекции была продемонстрирована в экспериментальных исследованиях на животных [43].

Chan BK et al. наблюдали то, что можно было бы назвать «эволюционной» синергией между антибиотиками и фагом [44]: устойчивость к фагу, который использует порин наружной мембраны в качестве рецепторного участка, привела к увеличению восприимчивости к антибиотикам различных классов, так как устойчивость к фагу порождала модификацию белка, ответственного за резистентность к антибиотику. Результаты исследований показывают, что отбор фагов приводит к эволюционному компромиссу: выработка устойчивости бактерий к атаке фагов способствует повышению чувствительности к лекарственным средствам из нескольких классов антибиотиков. Отдельные исследования продемонстрировали эффективность комбинаций фагов и антибиотиков на планктонных культурах P. aeruginosa [36-38] и биопленках [45].

В совместном исследовании специалистов из США и Пакистана, [46] представлены данные, аргументирующие клинический потенциал использования комбинаций антибиотиков и фагов для лечения раневых инфекций, вызванных P. aeruginosa. В то же время, по результатам исследования, отмечено, что некоторые антибиотики, в частности, ципрофлоксацин, гентамицин и тобрамицин подавляли репликацию фага. Из анализа представленных данных очевидно, что лечебная стратегия с использованием фагов в качестве антибактериальных средств может продлить срок службы используемых в настоящее время антибиотиков и потенциально снизить частоту инфекций, устойчивых к лечению антибиотиками.

Вывод: Данные литературы свидетельствуют, что в мире активно ведутся исследования бактериофагов как in vitro, так и in vivo - в эксперименте и клинике аргументирующие высокий потенциал клинического применения бактериофагов в комплексном лечении хронических ран мягких тканей. Перспективными направлениями являются исследования комбинированного взаимодействия бактериофагов и антибиотиков; бактериофагов и других биологически активных веществ; более детальное изучение воздействия бактериофагов на бактериальные биопленки; разработка новых способов доставки бактериофагов в область клинического интереса.

Об авторах

Игорь Евгеньевич Погодин

Университетская клиника федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: pogigevg@yandex.ru

травматолог-ортопед, научный сотрудник

Россия, 603155, Российская Федерация, Нижний Новгород, ул. Верхне-Волжская набережная, д. 18.

Вячеслав Михайлович Самойленко

Университетская клиника федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: samoylenko_v@yandex.ru

д-р мед.наук, научный сотрудник.

Россия, 603155, Российская Федерация, Нижний Новгород, ул. Верхне-Волжская набережная, д. 18.

Александр Геннадьевич Киргинцев

Университетская клиника федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: kirgintsev_ag@mail.ru

д-р мед.наук, научный сотрудник.

Россия, 603155, Российская Федерация, Нижний Новгород, ул. Верхне-Волжская набережная, д. 18.

Александ Сергееивич Лузан

Университетская клиника федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: tulupov.a.a@yandex.ru

травматолог-ортопед, научный сотрудник

Россия, 603155, Российская Федерация, Нижний Новгород, ул. Верхне-Волжская набережная, д. 18.

Список литературы

Дополнительные файлы