Possibilities and Prospects of Application of Bacteriophages in the Treatment of Chronic Soft Tissue Wounds

Full Text

Серьёзной проблемой, в том числе экономической, стоящей перед системами здравоохранения всего мира, являются хронические раны мягких тканей [1]. Хронической считают рану, существующую более 4 недель без признаков активного заживления, исключение составляют обширные раневые дефекты с признаками активной репарации [2, 3]. На практике — это раны, не достигающие показателя уменьшения площади на 50 % к исходу 4-й недели лечения [4]. В России, наличие хронических ран мягких тканей зарегистрировано более чем у 2,5 млн. человек, у 70 % пациентов такие раны многократно рецидивируют и значительно снижают качество жизни, являясь причиной продолжительных госпитализаций и периодов нетрудоспособности, что наносит весомый ущерб психоэмоциональному фону пациента и его ближайшего окружения [5]. Одной из причин длительного существования раневого дефекта является хирургическая инфекция, вызванная антибиотикорезистентными возбудителями, часто в виде биопленки [6, 7]. Так, по данным J.F. Guest et al. (2018) до 68% всех хронических ран у пациентов с сахарным диабетом клинически инфицированы на момент первичного осмотра, и еще у 23% пациентов в среднем через 4 месяца после появления дефекта кожи развивается раневая инфекция. В дальнейшем, несмотря на применение повязок с антисептиками, у 14% пациентов в процессе лечения сохраняются клинические признаки инфекции [8]. Во многих работах была продемонстрирована прямая связь между бактериальной нагрузкой и активностью репаративных процессов в ране [9-11]. Сокращение бактериальной нагрузки до уровня, приемлемого для макроорганизма, а также устранение из раневого дефекта наиболее вирулентных форм патогенных микроорганизмов является одним из общепризнанных принципов лечения ран. Перспективным направлением развития терапии, направленной на борьбу с антибиотикорезистентными микроорганизмами, в том числе в хронических ранах, является фаготерапия. Бактериофаги нетоксичны, высокоспецифичны и оставляют нормальную микробиоту нетронутой, что, несомненно, делает их хорошим выбором для применения у пациентов с хроническими заболеваниями и длительно незаживающими ранами [12].

Целью представленного обзора явилась систематизация представленной в современной научной литературе информации о проблеме использования фаготерапии для лечения хронических ран мягких тканей. В результате из электронных баз данных научных библиотек, (NCBI, elibrary) по ключевым словам «бактериофаги», «фаготерапия», «хронические раны» было выбрано 58 источников научной литературы (оригинальные научные исследования и обзорные статьи), из которых мы выделили 46 публикаций, подходящих по тематике исследования (исключено 12 статей). Большинство источников, исключенных из результата поиска были связаны с сообщениями о фагах, используемых с диагностической целью для индикации видового и внутривидового дифференцирования бактерий; либо рассматривающие аспекты молекулярной биологии и генной инженерии, затрагивающие изучение генома ДНК фага; или исследования, не рассматривающие фаги в качестве возможности их практического клинического применения.

Особенностью фаготерапии является высокая специфичность бактериофагов по отношению к бактериям-мишеням [13]. Это означает, что для получения активности широкого спектра действия более целесообразно использовать смесь фагов [14]. В исследовании [15] фаговый коктейль использовался против вызванной K. pneumonia инфекции ожоговой раны. Была доказана его эффективность для купирования инфекционного процесса без какой-либо вероятности образования устойчивых мутантов штамма. При этом, хотя результаты монофаговой терапии были также положительными, но фаговый коктейль был более эффективен по следующим критериям: бактериальная нагрузка, сокращение раны, активность миелопероксидазы кожи, образование коллагена. Авторы считают, что по сравнению с любым отдельным фагом, коктейль фагов значительно более эффективен в отношении появления устойчивых мутантов, следовательно, этот подход может служить эффективной стратегией лечения раневой инфекции у пациентов, которые не отвечают на традиционную терапию антибиотиками. Результаты других экспериментальных исследований на животных подтверждают безопасность и эффективность фагов при лечении хронических ран, инфицированных S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii [16, 17]. В ряде экспериментальных исследований показано, что литические фаги способствуют снижению плотности бактерий при местном инфекционном процессе [18], а в некоторых случаях даже более эффективны, чем антибиотики в предотвращении смертности от этих инфекций [19].

Поскольку хронизация раневого процесса ассоциирована с наличием в ране биопленки, в частности известно, что образцы отделяемого, полученного с поверхности хронических ран мягких тканей и исследованного при помощи электронной микроскопии в 60% случаев содержали бактериальные биопленки, в то время как в образцах, полученных из свежих ран процент выявления биоплёнок, составил лишь 6% [20], активно исследуется вопрос о возможности использования бактериофагов для борьбы с биопленками. С этой целью исследователи центра биоинженерии Португалии [21] использовали модель ex vivo – кожный эксплант свиньи, на котором была смоделирована рана, инфицированная микроорганизмами способными образовывать биоплёнки. В эксперименте использовали биопленки сформированные монокультурами мультирезистентных штаммов A.baumannii, P. aeruginosa, P. mirabilis и E.coli. Спустя сутки биопленки подвергались обработке бактериофагами: в качестве монопрепарата и фаговым коктейлем, содержащим фаги, видоспецифичные по отношению к исследуемым патогенам. Использование бактериофагов привело к значительному снижению бактериальной обсемененности, что доказало эффективность применения фагов в отношении бактериальных агентов, расположенных в биопленках. По мнению авторов, эффективность фаготерапии в клинической практике будет усиливаться за счет иммунных реакций организма.

В работе [22] доказано, что фаготерапия эффективна против раневых инфекций, вызванных P. aeruginosa. Критериями эффективности в этой работе кроме количественного бактериологического анализа и исследования биопленки, послужили просвечивающая электронная микроскопия и гель-электрофорез в импульсном поле. Авторы констатировали что фаг явился причиной значительного сокращения популяции бактерий как в планктонных клетках, так и в биопленках.

Коллективом исследователей из США, Швеции и Великобритании доказана гипотеза, заключающаяся в том, что, учитывая биохимические и экологические характеристики бактериофагов, они могут уничтожать бактерии в биопленках, поскольку оказывают более эффективное бактерицидное воздействие, чем антибиотики, в частности, ферменты полисахарид-деполимеразы, продуцируемые фагами, способны разрушать внеклеточный матрикс биопленки [23]. Лизируя бактерии вне биопленок, литические фаги стимулируют размножение клеток внутри этой структуры, тем самым делают бактерии внутри биопленки более метаболически активными и, таким образом, более восприимчивыми к уничтожению антибиотиками [24].

            В экспериментальном исследовании на модели раны мыши [25] была выполнена оценка влияния бактериофагов на биопленку антибиотикорезистентной P. aeruginosa. Результаты показали, что коктейль фагов оказывает на биопленку ингибирующее действие и количество бактерий в ране после обработки бактериофагами значительно уменьшается. Этот эффект был подтвержден в экспериментальном исследовании ученых из США, выполненном на модели ожоговой раны на мышах [22].

Механизм действия бактериофагов на биопленку сводится к следующим положениям [26]:

1. Бактериофаги реплицируются в своих клетках-хозяевах, что приводит к локализованному увеличению количества фагов (амплификация). Это увеличивает их концентрацию в биопленке. Распространяясь и уничтожая бактерии, продуцирующие материал для восстановления биопленки, бактериофаги снижают потенциал ее регенерации.
2. Бактериофаги могут нести или экспрессировать деполимеризующие ферменты, которые разрушают внеклеточное полимерное вещество биопленки.
3. Бактериальные клетки-персистеры могут быть инфицированы бактериофагами, при этом, хотя бактериофаги не могут реплицироваться и уничтожать неактивные клетки, они могут оставаться внутри этих бактерий до тех пор, пока они не активируются, а затем не начнут продуктивную инфекцию, которая затем разрушает клетки.

Еще одной приоритетной проблемой, которую решают несколько исследовательских групп в странах Европы, Азии и США является создание и поддержание достаточной концентрации бактериофагов в зоне клинического интереса при лечении раневой инфекции. В совместном исследовании французских, бельгийских и швейцарских ученых [27], выполненном в рамках европейского проекта "PhagoBurn", сделан вывод, что низкие концентрации фагов в области раневого дефекта приводят к неудачным исходам лечения. В основе решения этой проблемы лежит идея создания «депо бактериофагов» но, как оказалось, это является сложной технической задачей ввиду крайне малых (до 100 нм) размеров бактериофагов и для решения этой проблемы предлагается осуществлять иммобилизацию фагов в структуре полимерных носителей, что позволяет увеличить период их активности на раневой поверхности [28]. Для изучения возможности иммобилизации бактериофагов в различных материалах, служащих основой для раневых покрытий, было выполнено исследование учеными из Египта [29]. Авторы сравнивали материалы на основе биосовместимых нановолокон в комплексе с медом, поливиниловым спиртом, хитозаном и бактериофагом. Зафиксировано, что бактериофаг проявлял сильную антибактериальную активность по отношению ко всем испытуемым бактериальным штаммам и вызывал почти полное уничтожение множественной лекарственной устойчивости P. aeruginosa. Испытание in vivo показало улучшение результатов заживления ран, а тестирование цитотоксичности доказало хорошую биосовместимость. Авторы делают вывод о перспективности разработки раневых покрытий, включающих в себя бактериофаги.

Для иммобилизации бактериофагов предлагается использовать «подручные» средства. В частности, А.Г. Орлов и А.Н. Липин [30] предлагают наносить раствор, содержащий бактериофаги на коллагеновую гемостатическую губку и в дальнейшем укрывать ею трансплантат. Ученые из Португалии [31] изучали возможность применения фагов в комбинации с каштановым медом для уничтожения биопленок бактерий P. aeruginosa и E. coli. По мнению авторов, комбинирование бактериофагов и меда приводит к более эффективному уничтожению биопленки из-за способности мёда повреждать мембрану бактериальной клетки и проникать в матрицу биопленки, способствуя и усиливая последующую фаговую инвазию. В результате доказано сохранение жизнеспособности фагов в меде в течение 24 часов, при этом отмечено, что основными свойствами меда, которые вызывают потерю жизнеспособности фага, являются его низкий рН (от 3,2 до 4,5) и осмотическая активность за счет высокого содержания сахара (около 80%). В этой работе авторы стремились определить, оказывали ли комбинированные препараты с фагом и медом антибактериальный результат. Тестирование синергизма не являлось основной целью этого исследования.

Перспективным представляется способ, предложенный отечественными исследователями [32], и обеспечивающий иммобилизацию бактериофагов в гидрогелевой повязке, создаваемой ex tempore, что позволяет оперативно выполнять подбор бактериофагов, специфичных для возбудителей раневой инфекции, у каждого конкретного пациента. По этому же пути пошли индийские врачи [33], разработавшие повязку для лечения ожоговых ран, где в качестве носителя комбинации бактериофагов и антибиотиков использовали гидрогель на основе поливинилового спирта.

Сочетание бактериофагов и антибиотиков является одним из возможных и весьма привлекательных вариантов антибактериальной терапии. В литературе представлены исследования, обосновывающие ограничения на использование фага в качестве единственного агента для лечения бактериальных инфекций [34, 35], с другой стороны, имеются обоснованные предположения, что бактериофаги могут быть эффективным дополнением к лечению антибиотиками [36-38]. Комбинированное использование фага и антибиотиков может привести к ряду результатов. Два агента могут действовать аддитивно, то есть сумма их индивидуальных эффектов равна их комбинаторной эффективности. Они также могут действовать синергетически: их общая эффективность больше, чем по отдельности. Третий результат - отсутствие эффекта из-за отсутствия действия каждого из агентов. Наконец, может возникнуть антагонизм, при котором действие одного из агентов каким-то образом мешает действию другого. Исследованиям изучения этого взаимодействия посвящены работы нескольких авторских коллективов в разных странах. P. aeruginosa часто служит непосредственной причиной летальности пациентов с ожогами и поэтому является особенно привлекательным кандидатом для комбинированной терапии фагом и антибиотиками [39]. Как известно, P. aeruginosa обладает природной устойчивостью ко многим антибиотикам, однако в природе существует множество фагов P. aeruginosa, которые могут уничтожать эти бактерии и которые могут быть выделены из различных источников, включая сточные воды [40, 41].

В работе Schooley RT et al. была продемонстрирована аддитивную активность in vitro между бактериофагами и субингибирующими концентрациями миноциклина при использовании в комбинации против устойчивого к бактериофагу изолята A. baumannii при лечении свищевой формы инфицированной постнекротической псевдокисты поджелудочной железы [42]. Аддитивная или синергетическая активность бактериофагов и традиционных антибиотиков при лечении местной раневой инфекции была продемонстрирована в экспериментальных исследованиях на животных [43].

Chan BK et al. наблюдали то, что можно было бы назвать «эволюционной» синергией между антибиотиками и фагом [44]: устойчивость к фагу, который использует порин наружной мембраны в качестве рецепторного участка, привела к увеличению восприимчивости к антибиотикам различных классов, так как устойчивость к фагу порождала модификацию белка, ответственного за резистентность к антибиотику. Результаты исследований показывают, что отбор фагов приводит к эволюционному компромиссу: выработка устойчивости бактерий к атаке фагов способствует повышению чувствительности к лекарственным средствам из нескольких классов антибиотиков. Отдельные исследования продемонстрировали эффективность комбинаций фагов и антибиотиков на планктонных культурах P. aeruginosa [36-38] и биопленках [45].

В совместном исследовании специалистов из США и Пакистана, [46] представлены данные, аргументирующие клинический потенциал использования комбинаций антибиотиков и фагов для лечения раневых инфекций, вызванных P. aeruginosa. В то же время, по результатам исследования, отмечено, что некоторые антибиотики, в частности, ципрофлоксацин, гентамицин и тобрамицин подавляли репликацию фага. Из анализа представленных данных очевидно, что лечебная стратегия с использованием фагов в качестве антибактериальных средств может продлить срок службы используемых в настоящее время антибиотиков и потенциально снизить частоту инфекций, устойчивых к лечению антибиотиками.

Вывод: Данные литературы свидетельствуют, что в мире активно ведутся исследования бактериофагов как in vitro, так и in vivo - в эксперименте и клинике аргументирующие высокий потенциал клинического применения бактериофагов в комплексном лечении хронических ран мягких тканей. Перспективными направлениями являются исследования комбинированного взаимодействия бактериофагов и антибиотиков; бактериофагов и других биологически активных веществ; более детальное изучение воздействия бактериофагов на бактериальные биопленки; разработка новых способов доставки бактериофагов в область клинического интереса.

About the authors

Vladimir Pogodin

University clinic Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Privolzhsky Research Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: pogigevg@yandex.ru

traumatologist-orthopedist, researcher

Russian Federation, 603155, Russian Federation, Nizhnij Novgorod, Verhne-Volzhskaya naberezhnaya Str., 18.

Vyacheslav Samoylenko

University clinic Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Privolzhsky Research Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: samoylenko_v@yandex.ru

M.D., researcher

Russian Federation, 603155, Russian Federation, Nizhnij Novgorod, Verhne-Volzhskaya naberezhnaya Str., 18.

Alexander Kirgintsev

University clinic Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Privolzhsky Research Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: kirgintsev_ag@mail.ru

M.D., researcher

Russian Federation, 603155, Russian Federation, Nizhnij Novgorod, Verhne-Volzhskaya naberezhnaya Str., 18.

Alexandr Luzan

University clinic Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Privolzhsky Research Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: tulupov.a.a@yandex.ru

traumatologist-orthopedist, researcher

Russian Federation, 603155, Russian Federation, Nizhnij Novgorod, Verhne-Volzhskaya naberezhnaya Str., 18.

References

Supplementary files