Современные подходы в изучении печёночной недостаточности на биологических моделях

Полный текст

Состояние, при котором функциональные возможности печени не соответствуют требованиям, предъявляемым организмом, получило название печеночной дисфункции, которую можно разделить на острую (ОПН) и хроническую печёночную недостаточность (ХПН).

В 32% случаев причиной развития ОПН у хирургических больных является недостаточное количество функционирующих гепатоцитов после резекции или трансплантации печеночной паренхимы [1]. ОПН является одной из шести основных причин смерти госпитализированных пациентов в возрасте от 35 до 60 лет [2, 3], которая при развитии печеночной комы приводит к летальности приблизительно в 90% случаев [4].

На сегодняшний день по данным ВОЗ в развивающихся странах ХПН является одной из десяти ведущих причин смерти людей. В развитых странах ХПН встречается у 0,03% населения, однако летальность от неё и возможность осложнений сохраняются на высоком уровне [2, 5]. ВОЗ прогнозирует [6], что в ближайшие 10-20 лет смертность от заболеваний печени может вырасти в 2 раза.

В связи с этим, медицинская и социальная значимость проблемы профилактики и лечения печеночной недостаточности является актуальной, что требует углубленного изучения этого состояния на биологических моделях.

Для моделирования поражений печени, вызванных различными патологическими процессами, нужны соответствующие различные экспериментальные модели, в связи с чем особую актуальность приобретает разработка новых подходов к моделированию печёночной недостаточности. [7]

Выделяют несколько способов моделирования ОПН: хирургические, токсические и комбинированные.

Хирургические способы основаны на уменьшении количества функционирующих гепатоцитов путем проведения типичных или атипичных резекций. Такие модели позволяют изучать механизмы пострезекционной и пострансплантационной ОПН [2].

Хирургические операции для моделирования ОПН рекомендуют проводить в утренние часы (9:00 – 12:00), т.к. в это время митотическая активность клеток печени достигает минимума [8].

Один из способов создания хирургической модели ОПН – резекция 65-70% паренхимы печени, которую на лабораторных крысах выполняют путем удаления ее левой и средней долей [2, 9, 10].

Для моделирования ОПН также применяют субтотальную резекцию печени, при которой у крыс удаляют левую боковую, срединную и правую верхнюю доли [8, 9, 11].

При этом у животных отмечается значительное увеличение уровней АлАТ, АсАТ, γ-глутамилтранспептидазы, общего билирубина и щелочной фосфатазы, что при резекции 65-70% паренхимы свидетельствует о нарушении ее функции, при субтотальной резекции – приводит к развитии критического дефицита функционирующей ткани печени, высокой летальности и значительному расходу лабораторных животных [2, 8, 10].

Используются также хирургические модели ОПН, основанные на наложении портокавального шунта и временной клипсы на печеночную артерию, что приводит к частичной деваскуляризации, апоптозу, некрозу и снижению массы печеночной ткани и сопровождается незначительным повышением уровня аминотрансфераз крови животных [12].

Токсические модели ОПН основаны на введении в организм лабораторного животного гепатотропных ядов и используются для изучения динамики восстановительных процессов под влиянием терапевтических средств на хирургически интактную печень.

Например, мышам внутрибрюшинно вводят 5% водный раствор D-галактозамина (D-GalN) в дозе 400 мг/кг [13, 14, 15], который изменяет синтез нуклеиновых кислот и белка, что приводит к нарушению ультраструктуры гепатоцитов, разрушению их мембран, развитию колликвационного некроза.

Следующая токсическая модель для изучения ОПН основана на внутрибрюшинном введении мышам липополисахарида в дозе 100 мкг/кг, который активирует воспалительный процесс, влияет на липидный обмен и может вызвать стеатоз печени [16, 17]. Часто ОПН моделируется путём комбинирования введения липополисахарида и D-GalN [14, 18].

Для создания токсической модели ОПН у крыс также используется внутрижелудочное введение 25% суспензии парацетамола на крахмальной слизи в дозе 2500 мг действующего вещества на 1 кг массы тела животного[19, 20]. Механизм действия парацетамола основан на его преобразовании в N-ацетил-р-бензохинонимин, который запускает каскад митоген-активируемых протеинкиназ с развитием в митохондриях оксидантного стресса, повышением проницаемости митохондриальной мембраны и высвобождением фактора, вызывающего апоптоз [19, 20].

Широко применяется способ моделирования ОПН с использованием тетрахлорметана (четырёххлористый углерод, фреон-10, хладон-10), который подкожно вводят крысам из расчета 200 мкг на 100 г массы тела животного в объемном соотношении с персиковым маслом – 1:1, что приводит к нарушению целостности мембран гепатоцитов и усилению перекисного окисления липидов, с развитием фиброзирующего повреждения печени [2, 21]. У экспериментальных животных наблюдается снижение массы печени, разрастание соединительной ткани, изменение эндотелия желчных капилляров [21]. Также известны способы моделирования ОПН с использованием этанола, празеодима, тиоацетамида в высоких дозировках [22], α-аманитина, парацетамола [13, 23], ацетаминофена [24], эпигаллокатехин-3-галлата [25], облучения лабораторных животных [26].

Таким образом, токсические модели с использованием галактозамина могут иллюстрировать процессы в печени, происходящие при остром вирусном гепатите [19]; парацетамола – при отравлении данным препаратом, которое является наиболее частой причиной ОПН в мире; тетрахлорметана с персиковым маслом – цирротических изменениях; липополисахарида, этанола, празеодима и облучения – при трансплантации или введении лекарственных средств [17, 21].

ХПН моделируется разными способами: токсическими (тетрахлорметан, тиоацетамид, дипин, совтол-1 и др.); хирургическими (перевязка желчных протоков); диетическими (холин-дефицитная диета и др.); генетическими (внедрение экзогенных генов в зародышевую линю, сочетание гепатотоксинов с гепатоканцерогенами)[2]. При этом моделирование ХПН имеет особенности, связанные высокой скоростью регенеративных процессов в печени, что позволяет ей сравнительно быстро компенсировать нанесённый вред.[27]

Среди токсических моделей наиболее часто используется тетрахлорметан (четырёххлористый углерод, фреон-10, хладон-10), дозировка которого зависит от требуемой тяжести поражения печени. Например, известна модель ХПН, при которой лабораторным животным вводится 50% раствор тетрахлорметана: в первый день 0,1 мл тетрахлорметана + 0,4 мл оливкового масла на 100 г массы тела животного, во второй день – 0,3 мл токсина + 0,2 мл оливкового масла [28]. В эти дни и на протяжении последующего эксперимента (65 суток) животным перорально вместо питьевой воды дают этиловый спирт [28]. При этом в крови лабораторных животных повышается уровень общего билирубина, АлАТ, АсАТ, креатинина, снижение уровня глюкозы [28].

Для менее значительного поражения печени можно вводить раствор тетрахлорметана на кукурузном масле в соотношении 1:4 до 0,05 мл на 100 г массы тела животного дважды в неделю на протяжении 12 недель [29].

Существует модель, при которой подкожно 2 раза в неделю вводят 60% масляный раствор тетрахлорметана на протяжении 6 недель (42 дня) [30]. Во время первой инъекции вводится 0,5 мл, последующих – по 0,3 мл препарата на 100 г массы тела животного, до достижения суммарной дозы в 3,5 мл на 100 г массы тела животного [30]. Данное повреждение печени является спонтанно обратимым и характеризуется только морфологическими и не резко выраженными биохимическими нарушениями в крови [2, 31, 32].

Для создания более устойчивой модели ХПН крысам сначала на протяжении двух недель вводят 0,5 мл 60% масляного раствора тетрахлорметана на 100 г массы 2 раза в неделю с интервалом в 3-4 дня, затем дозировку снижают до 0,3 мл на 100 г веса с той же периодичностью [2]. Начиная с 5 недели затравки в течение 3-х недель каждые 7 дней вводят по 1 мл неполного адъюванта Фрейнда на фоне продолжающейся затравки тетрахлорметаном по 0,5 мл 60% масляного растворана 100 г веса 1 раз в неделю, причем адъювант вводят за 1 сутки до введения тетрахлорметана [2]. Таким образом ингибируют регенераторные процессы в печени путем активации в ней хронического иммунного воспаления на фоне продолжающегося токсического повреждения[2, 33].

В другой модели токсическое повреждение печени осуществляется путем внутрижелудочного введения в течение 4-8 недель 50% раствора совтола-1 на оливковом масле (по 0,25 мл раствора на 100 г массы тела животного), действие которого усиливается дополнительным пероральным введением 10% раствора этанола вместо питьевой воды [2].

Для моделирования ХПН возможно использование тиоацетамида (ТАА), продукты метаболизма которого вызывают некроз гепатоцитов [34]. По сравнению с другими гепатотоксинами ТАА требуется больше времени, чтобы вызвать значительный фиброз, что увеличивает риск преждевременной потери подопытных животных из-за развития холангиокарциномы [34]. Помимо инъекционного введения, TAA также можно вводить перорально или внутрижелудочно, но при этом наблюдается токсическое повреждение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, невозможно точно дозировать количество поступившего в кровь токсина [2].

Следующая токсическая модель основана на введении диметила или диэтилнитрозамина. Данные препараты гидроксилизуются в клетках печени с образованием биоактивных промежуточных продуктов, индуцируют мутации ДНК, приводят к некрозу гепатоцитов с образованием центропортальных фиброзных перегородок. При этом дозировка и время введения токсина может сильно зависеть от вида, линии, пола и возраста животных [34]. Также возможно моделирование ХПН с помощью перорального введения подопытным животным раствора хлората магния [35]. Гепатотоксичные вещества рекомендуется вводить в утренние часы, чтобы суточные колебания митотической активности клеток печени не оказывали влияния на ход эксперимента[32].

Среди хирургических методов моделирования ХПН ведущее место занимает перевязка желчных протоков, что стимулирует пролиферацию их эпителиальных клеток, вызывает холестаз, портальное воспаление, фиброз, вторичный билиарный цирроз печени и печеночную недостаточность[12, 34]. При этом пресинусоидальный фиброз развивается у животных на 10-е сутки, а перипортальный – на 20-е сутки и прогрессирует во время всего эксперимента[12, 36]. Эта модель получила широкое распространение из-за несложного, но эффективного оперативного вмешательства, приводящего к формированию у животных ХПН [12].

Также хирургическим способом моделирования ХПН является резекция 15-20% массы печени (удаление части левой доли у наркотизированных крыс) [37], при этом наблюдается липодистрофия, преимущественное поражение центролобулярных зон. [36]

Примером диетической модели является холиндефицитная диета, которая способствует стимуляции синтеза триглицеридов из фосфатидной кислоты вместо фосфолипидов, в результате чего формируется жировой гепатоз печени, ХПН [12, 36]. Существуют также токсико-алиментарные модели, заключающиеся в добавлении в рацион лабораторных животных тугоплавких жиров (свиного сала) в сочетании с внутрибрюшинным введением тетрахлорметана и тиоацетамида [38, 39], а также комбинированне модели, при которых производится затравка лабораторных животных тетрахлорметаном на фоне кормления тугоплавкими жирами, после чего производится резекция 15-20% массы печени [24].

К генетическим способам моделирования ХПН относят технологию трансгенных животных, позволяющую внедрять экзогенные гены в зародышевую линию или нарушать работу отдельных генов [34]. В последнее десятилетие многочисленные генетически модифицированные модели комбинируются с профибротическими стимулами, что позволяет исследователям оценить функцию различных генов в развитии печеночной недостаточности [34, 36, 40].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, для изучения этиологии и патогенеза печёночной недостаточности, разработки новых методов диагностики, поиска новых лекарственных препаратов и методов их введения необходимо создание биологических моделей, максимально точно иллюстрирующих клиническую картину этого патологического состояния. Существует множество методов моделирования данной патологии, различающихся по поражающим факторам, степени повреждения и обратимости процесса, по-разному проявляются биохимические и морфологические изменения. При выборе способа воспроизведения печеночной недостаточности исследователю следует учитывать достоинства и недостатки модели, условия проведения и предполагаемый результат эксперимента.

Об авторах

Анастасия Юрьевна Лаптиёва

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Email: laptievaa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3307-1425

аспирант кафедры общей и амбулаторной хирургии Воронежского государственного медицинского университета им. Н.Н.Бурденко

Россия, 394036, Российская Федерация, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

Александр Анатольевич Глухов

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Email: glukhov-vrn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9675-7611

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей и амбулаторной хирургии

Россия, 394036, Российская Федерация, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

Александр Алексеевич Андреев

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Email: sugery@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5242-6105

доктор медицинских наук, профессор кафедры общей и амбулаторной хирургии

Россия, 394036, Российская Федерация, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

Мария Сергеевна Верлянко

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Email: ms.vms2001@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3175-6228

студентка

Россия, 394036, Российская Федерация, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

Антон Петрович Остроушко

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Автор, ответственный за переписку.
Email: antonostroushko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3656-5954

кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей и амбулаторной хирургии

Россия, 394036, Российская Федерация, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10

Список литературы

Дополнительные файлы