Modern Approaches to the Study of Liver Failure on Biological Models

Full Text

Состояние, при котором функциональные возможности печени не соответствуют требованиям, предъявляемым организмом, получило название печеночной дисфункции, которую можно разделить на острую (ОПН) и хроническую печёночную недостаточность (ХПН).

В 32% случаев причиной развития ОПН у хирургических больных является недостаточное количество функционирующих гепатоцитов после резекции или трансплантации печеночной паренхимы [1]. ОПН является одной из шести основных причин смерти госпитализированных пациентов в возрасте от 35 до 60 лет [2, 3], которая при развитии печеночной комы приводит к летальности приблизительно в 90% случаев [4].

На сегодняшний день по данным ВОЗ в развивающихся странах ХПН является одной из десяти ведущих причин смерти людей. В развитых странах ХПН встречается у 0,03% населения, однако летальность от неё и возможность осложнений сохраняются на высоком уровне [2, 5]. ВОЗ прогнозирует [6], что в ближайшие 10-20 лет смертность от заболеваний печени может вырасти в 2 раза.

В связи с этим, медицинская и социальная значимость проблемы профилактики и лечения печеночной недостаточности является актуальной, что требует углубленного изучения этого состояния на биологических моделях.

Для моделирования поражений печени, вызванных различными патологическими процессами, нужны соответствующие различные экспериментальные модели, в связи с чем особую актуальность приобретает разработка новых подходов к моделированию печёночной недостаточности. [7]

Выделяют несколько способов моделирования ОПН: хирургические, токсические и комбинированные.

Хирургические способы основаны на уменьшении количества функционирующих гепатоцитов путем проведения типичных или атипичных резекций. Такие модели позволяют изучать механизмы пострезекционной и пострансплантационной ОПН [2].

Хирургические операции для моделирования ОПН рекомендуют проводить в утренние часы (9:00 – 12:00), т.к. в это время митотическая активность клеток печени достигает минимума [8].

Один из способов создания хирургической модели ОПН – резекция 65-70% паренхимы печени, которую на лабораторных крысах выполняют путем удаления ее левой и средней долей [2, 9, 10].

Для моделирования ОПН также применяют субтотальную резекцию печени, при которой у крыс удаляют левую боковую, срединную и правую верхнюю доли [8, 9, 11].

При этом у животных отмечается значительное увеличение уровней АлАТ, АсАТ, γ-глутамилтранспептидазы, общего билирубина и щелочной фосфатазы, что при резекции 65-70% паренхимы свидетельствует о нарушении ее функции, при субтотальной резекции – приводит к развитии критического дефицита функционирующей ткани печени, высокой летальности и значительному расходу лабораторных животных [2, 8, 10].

Используются также хирургические модели ОПН, основанные на наложении портокавального шунта и временной клипсы на печеночную артерию, что приводит к частичной деваскуляризации, апоптозу, некрозу и снижению массы печеночной ткани и сопровождается незначительным повышением уровня аминотрансфераз крови животных [12].

Токсические модели ОПН основаны на введении в организм лабораторного животного гепатотропных ядов и используются для изучения динамики восстановительных процессов под влиянием терапевтических средств на хирургически интактную печень.

Например, мышам внутрибрюшинно вводят 5% водный раствор D-галактозамина (D-GalN) в дозе 400 мг/кг [13, 14, 15], который изменяет синтез нуклеиновых кислот и белка, что приводит к нарушению ультраструктуры гепатоцитов, разрушению их мембран, развитию колликвационного некроза.

Следующая токсическая модель для изучения ОПН основана на внутрибрюшинном введении мышам липополисахарида в дозе 100 мкг/кг, который активирует воспалительный процесс, влияет на липидный обмен и может вызвать стеатоз печени [16, 17]. Часто ОПН моделируется путём комбинирования введения липополисахарида и D-GalN [14, 18].

Для создания токсической модели ОПН у крыс также используется внутрижелудочное введение 25% суспензии парацетамола на крахмальной слизи в дозе 2500 мг действующего вещества на 1 кг массы тела животного[19, 20]. Механизм действия парацетамола основан на его преобразовании в N-ацетил-р-бензохинонимин, который запускает каскад митоген-активируемых протеинкиназ с развитием в митохондриях оксидантного стресса, повышением проницаемости митохондриальной мембраны и высвобождением фактора, вызывающего апоптоз [19, 20].

Широко применяется способ моделирования ОПН с использованием тетрахлорметана (четырёххлористый углерод, фреон-10, хладон-10), который подкожно вводят крысам из расчета 200 мкг на 100 г массы тела животного в объемном соотношении с персиковым маслом – 1:1, что приводит к нарушению целостности мембран гепатоцитов и усилению перекисного окисления липидов, с развитием фиброзирующего повреждения печени [2, 21]. У экспериментальных животных наблюдается снижение массы печени, разрастание соединительной ткани, изменение эндотелия желчных капилляров [21]. Также известны способы моделирования ОПН с использованием этанола, празеодима, тиоацетамида в высоких дозировках [22], α-аманитина, парацетамола [13, 23], ацетаминофена [24], эпигаллокатехин-3-галлата [25], облучения лабораторных животных [26].

Таким образом, токсические модели с использованием галактозамина могут иллюстрировать процессы в печени, происходящие при остром вирусном гепатите [19]; парацетамола – при отравлении данным препаратом, которое является наиболее частой причиной ОПН в мире; тетрахлорметана с персиковым маслом – цирротических изменениях; липополисахарида, этанола, празеодима и облучения – при трансплантации или введении лекарственных средств [17, 21].

ХПН моделируется разными способами: токсическими (тетрахлорметан, тиоацетамид, дипин, совтол-1 и др.); хирургическими (перевязка желчных протоков); диетическими (холин-дефицитная диета и др.); генетическими (внедрение экзогенных генов в зародышевую линю, сочетание гепатотоксинов с гепатоканцерогенами)[2]. При этом моделирование ХПН имеет особенности, связанные высокой скоростью регенеративных процессов в печени, что позволяет ей сравнительно быстро компенсировать нанесённый вред.[27]

Среди токсических моделей наиболее часто используется тетрахлорметан (четырёххлористый углерод, фреон-10, хладон-10), дозировка которого зависит от требуемой тяжести поражения печени. Например, известна модель ХПН, при которой лабораторным животным вводится 50% раствор тетрахлорметана: в первый день 0,1 мл тетрахлорметана + 0,4 мл оливкового масла на 100 г массы тела животного, во второй день – 0,3 мл токсина + 0,2 мл оливкового масла [28]. В эти дни и на протяжении последующего эксперимента (65 суток) животным перорально вместо питьевой воды дают этиловый спирт [28]. При этом в крови лабораторных животных повышается уровень общего билирубина, АлАТ, АсАТ, креатинина, снижение уровня глюкозы [28].

Для менее значительного поражения печени можно вводить раствор тетрахлорметана на кукурузном масле в соотношении 1:4 до 0,05 мл на 100 г массы тела животного дважды в неделю на протяжении 12 недель [29].

Существует модель, при которой подкожно 2 раза в неделю вводят 60% масляный раствор тетрахлорметана на протяжении 6 недель (42 дня) [30]. Во время первой инъекции вводится 0,5 мл, последующих – по 0,3 мл препарата на 100 г массы тела животного, до достижения суммарной дозы в 3,5 мл на 100 г массы тела животного [30]. Данное повреждение печени является спонтанно обратимым и характеризуется только морфологическими и не резко выраженными биохимическими нарушениями в крови [2, 31, 32].

Для создания более устойчивой модели ХПН крысам сначала на протяжении двух недель вводят 0,5 мл 60% масляного раствора тетрахлорметана на 100 г массы 2 раза в неделю с интервалом в 3-4 дня, затем дозировку снижают до 0,3 мл на 100 г веса с той же периодичностью [2]. Начиная с 5 недели затравки в течение 3-х недель каждые 7 дней вводят по 1 мл неполного адъюванта Фрейнда на фоне продолжающейся затравки тетрахлорметаном по 0,5 мл 60% масляного растворана 100 г веса 1 раз в неделю, причем адъювант вводят за 1 сутки до введения тетрахлорметана [2]. Таким образом ингибируют регенераторные процессы в печени путем активации в ней хронического иммунного воспаления на фоне продолжающегося токсического повреждения[2, 33].

В другой модели токсическое повреждение печени осуществляется путем внутрижелудочного введения в течение 4-8 недель 50% раствора совтола-1 на оливковом масле (по 0,25 мл раствора на 100 г массы тела животного), действие которого усиливается дополнительным пероральным введением 10% раствора этанола вместо питьевой воды [2].

Для моделирования ХПН возможно использование тиоацетамида (ТАА), продукты метаболизма которого вызывают некроз гепатоцитов [34]. По сравнению с другими гепатотоксинами ТАА требуется больше времени, чтобы вызвать значительный фиброз, что увеличивает риск преждевременной потери подопытных животных из-за развития холангиокарциномы [34]. Помимо инъекционного введения, TAA также можно вводить перорально или внутрижелудочно, но при этом наблюдается токсическое повреждение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, невозможно точно дозировать количество поступившего в кровь токсина [2].

Следующая токсическая модель основана на введении диметила или диэтилнитрозамина. Данные препараты гидроксилизуются в клетках печени с образованием биоактивных промежуточных продуктов, индуцируют мутации ДНК, приводят к некрозу гепатоцитов с образованием центропортальных фиброзных перегородок. При этом дозировка и время введения токсина может сильно зависеть от вида, линии, пола и возраста животных [34]. Также возможно моделирование ХПН с помощью перорального введения подопытным животным раствора хлората магния [35]. Гепатотоксичные вещества рекомендуется вводить в утренние часы, чтобы суточные колебания митотической активности клеток печени не оказывали влияния на ход эксперимента[32].

Среди хирургических методов моделирования ХПН ведущее место занимает перевязка желчных протоков, что стимулирует пролиферацию их эпителиальных клеток, вызывает холестаз, портальное воспаление, фиброз, вторичный билиарный цирроз печени и печеночную недостаточность[12, 34]. При этом пресинусоидальный фиброз развивается у животных на 10-е сутки, а перипортальный – на 20-е сутки и прогрессирует во время всего эксперимента[12, 36]. Эта модель получила широкое распространение из-за несложного, но эффективного оперативного вмешательства, приводящего к формированию у животных ХПН [12].

Также хирургическим способом моделирования ХПН является резекция 15-20% массы печени (удаление части левой доли у наркотизированных крыс) [37], при этом наблюдается липодистрофия, преимущественное поражение центролобулярных зон. [36]

Примером диетической модели является холиндефицитная диета, которая способствует стимуляции синтеза триглицеридов из фосфатидной кислоты вместо фосфолипидов, в результате чего формируется жировой гепатоз печени, ХПН [12, 36]. Существуют также токсико-алиментарные модели, заключающиеся в добавлении в рацион лабораторных животных тугоплавких жиров (свиного сала) в сочетании с внутрибрюшинным введением тетрахлорметана и тиоацетамида [38, 39], а также комбинированне модели, при которых производится затравка лабораторных животных тетрахлорметаном на фоне кормления тугоплавкими жирами, после чего производится резекция 15-20% массы печени [24].

К генетическим способам моделирования ХПН относят технологию трансгенных животных, позволяющую внедрять экзогенные гены в зародышевую линию или нарушать работу отдельных генов [34]. В последнее десятилетие многочисленные генетически модифицированные модели комбинируются с профибротическими стимулами, что позволяет исследователям оценить функцию различных генов в развитии печеночной недостаточности [34, 36, 40].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, для изучения этиологии и патогенеза печёночной недостаточности, разработки новых методов диагностики, поиска новых лекарственных препаратов и методов их введения необходимо создание биологических моделей, максимально точно иллюстрирующих клиническую картину этого патологического состояния. Существует множество методов моделирования данной патологии, различающихся по поражающим факторам, степени повреждения и обратимости процесса, по-разному проявляются биохимические и морфологические изменения. При выборе способа воспроизведения печеночной недостаточности исследователю следует учитывать достоинства и недостатки модели, условия проведения и предполагаемый результат эксперимента.

About the authors

Anastasia Yurievna Laptiyova

Voronezh N.N. Burdenko State Medical University

Email: laptievaa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3307-1425

graduate student of the Department of General and Outpatient Surgery

Russian Federation, 10 Studencheskaya str. Voronezh, 394036, Russia

Alexander Anatolievich Glukhov

Voronezh N.N. Burdenko State Medical University

Email: glukhov-vrn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9675-7611

M.D., Professor, head of the Department of General and Outpatient Surgery

Russian Federation, 10 Studencheskaya str. Voronezh, 394036, Russia

Alexander Alekseevich Andreev

Voronezh N.N. Burdenko State Medical University

Email: sugery@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5242-6105

M.D., Professor of the Department of General and Outpatient Surgery

Russian Federation, 10 Studencheskaya str. Voronezh, 394036, Russia

Maria Sergeevna Verlyanko

Voronezh N.N. Burdenko State Medical University

Email: ms.vms2001@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3175-6228

student

Russian Federation, 10 Studencheskaya str. Voronezh, 394036, Russia

Anton Petrovich Ostroushko

Voronezh N.N. Burdenko State Medical University

Author for correspondence.
Email: antonostroushko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3656-5954

Ph.D., associate Professor of the Department of General and Outpatient Surgery

Russian Federation, 10 Studencheskaya str. Voronezh, 394036, Russia

References

Supplementary files