Иммунотропное действие ронколейкина при различных способах введения в условиях экспериментального распространенного гнойного перитонита

Лечение распространенного гнойного перитонита (РГП) остается одним из наиболее сложных вопросов неотложной хирургии органов брюшной полости. Актуальность и социальная значимость данной проблемы обусловлена ростом числа больных и гнойно-септических осложнений, а также стабильно высоким уровнем летальности [5, 6, 7, 11, 23, 26, 30].

Результаты лечения больных перитонитом определяются не только адекватностью выполненного оперативного вмешательства и полнотой интенсивной терапии послеоперационного периода. Во многом они зависят от состояния иммунной системы пациента и своевременно проводимой коррекции возникающих в ней нарушений [4, 13, 18, 20, 24, 25, 27]. Развитие абдоминального сепсиса с массивной бактериальной токсемией и антигенной гиперстимуляцией системы иммунитета, оперативное вмешательство, антимикробная терапия способствуют развитию комбинированного вторичного иммунодефицита [4, 7, 9, 13, 25, 28]. В условиях РГП происходит быстрое смещение цитокинового профиля в сторону противовоспалительных иммуносупрессорных реакций [12].

Важным звеном в патогенезе иммунной дисфункции является дефицит эндогенного ИЛ-2 [8, 12, 13, 29]. Этот цитокин, продуцируемый Т-лимфоцитами, является одним из ключевых компонентов общей цитокиновой сети, поскольку участвует в формировании адекватной иммунореактивности [8, 13, 31, 32].

Известно, что заместительная иммунокоррекция препаратом рекомбинантного ИЛ-2 «Ронколейкин» при РПГ способствует купированию явлений полиорганной недостаточности и снижению летальности [1-3, 15, 17, 19].

Описаны внутривенный и подкожный способы введения ронколейкина при перитоните, а также использование с данной целью метода экстракорпоральной иммунофармакотерапии [3, 9, 10, 14, 21, 22]. Внутрикожное введение, а также сравнительная оценка эффективности различных способов введения ронколейкина при перитоните в литературе не описаны.

Острая воспалительная реакция в брюшной полости с участием полиморфноядерных нейтрофилов, как клеток первой линии неспецифической иммунной защиты организма от микробной агрессии, играет одну из основных патогенетических ролей в развивающемся на местном и системном уровнях воспалительном ответе, патогенезе сепсиса и полиорганных нарушений у пациентов с РПГ [7, 9, 4, 27, 29]. В связи с этим, изучение влияния способов введения ронколейкина на процессы кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток с клетками острого воспаления в условиях перитонита представляется весьма перспективным.

Цель исследования – изучить иммунокоррегирующее действие ронколейкина на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток иммунных органов при различных способах введения препарата в условиях экспериментального РПГ.

Материалы и методы

Эксперимент выполнен на 70 кроликах-самцах породы шиншилла, массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы: I – норма, n=5; II – 6-ти часовой РГП, n=5; III – контрольная (хирургическое лечение РГП), n=15; IV – хирургическое лечение РГП с внутривенным введением в послеоперационном периоде Ронколейкина, n=15. V – хирургическое лечение распространенного гнойного перитонита с подкожным введением в послеоперационном периоде препарата «Ронколейкин», n=15; VI – хирургическое лечение РГП с внутрикожным введением в послеоперационном периоде Ронколейкина), n=15.

Животные содержались в виварии, в соответствии с международными правилами GLP. Для моделирования РГП использовали микробную взвесь, состоящую из равных количеств аэробов (E.coli, штамм 0111 К58 НИ С 130-53) и анаэробов (B.Fragilis, штамм 323). Микробную взвесь вводили в брюшную полость животных стерильным шприцем из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Через 6 часов после введения микроорганизмов в III, IV, V и VI группах животных с целью лечения перитонита и устранения энтеральной недостаточности выполняли лапаротомию, санацию брюшной полости, декомпрессию тонкой кишки. Животных с РГП выводили из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 часов после заражения и на 1, 3 и 5-е сутки послеоперационного периода.

Животным IV и V групп в послеоперационном периоде (в течение 5-и суток) ежедневно два раза в сутки внутривенно капельно и подкожно соответственно вводили Ронколейкин из расчёта 10 000 МЕ/кг, VI-ой группы – Ронколейкин из расчёта 3 000 МЕ/кг, III группы – эквивалентный объем 0,9%-ного раствора натрия хлорида.

Для иммунологического исследования выполнялся забор венозной крови, селезенки, Пейеровых бляшек и подкожных лимфатических узлов.

Из данных органов готовились клеточные суспензии (107/мл) с использованием культуральной среды (КС), состоящей из среды RPMI-1640 (Sigma, США), 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина и 100 мкг/мл гентамицина. Полученные клеточные суспензии центрифугировались в двойном градиенте раствора фиккола-верографина [25]. Затем мононуклеарные лейкоциты, находящиеся в интерфазном кольце, собирали и дважды отмывали в изотоническом фосфатном буфере. В части исследований мононуклеарные лейкоциты разделяли на лимфоциты и моноциты по способности последних адгезироваться на пластиковой поверхности чашек Петри.

Митогениндуцированная цитокинпродуцирующая активность иммунокомпетентных клеток изучалась в реакции миграции нейтрофильных лейкоцитов (РМЛ) в прямом капиллярном тесте [25]. Для этого, в три ячейки круглодонного планшета для иммунологических исследований вносилось по 0,2 мл суспензии соответствующих иммунокомпетентных клеток. В первую ячейку добавляли 10 мкл фитогемагглютинина (ФГА) (40 мкг/мл), во вторую – 10 мкл липополисахарида (ЛПС) E. Coli (10 мкг/мл), в третью – 10 мкл среды RPMJ-1640. Планшет инкубировали при 370С, 5% СО2 в течение 1,5 часов с последующей элиминацией митогенов путем 2-х кратного центрифугирования при 1000 об/мин в течение 3 минут. К осадку добавляли 0,1 мл (107/мл) суспензии нейтрофильных лейкоцитов (НЛ), приготовленных на культуральной среде. НЛ получали из селезенки кроликов путем центрифугирования в двойном градиенте плотности фиккола-верографина.

Результаты РМЛ выражались в индексе миграции (ИМ), который определяли по формуле:

количество НЛ, мгрировавших из капилляров 
с митотгениндуцированными клетками

количество НЛ, мигрировавших из капилляров
с интактными клетками.

Статистическую обработку данных проводили с использованием электронных пакетов анализа «STATISTICA 6.0» и «Excel». Поскольку распределение признаков носило правильный характер, а дисперсии в сравниваемых группах не отличались, были использованы методы описательной статистики, t-критерий Стьюдента (уровень достоверности отличий средних значений р<0,05).

Результаты и их обсуждение

В первой серии опытов изучалось влияние митоген-индуцированных ИКК (иммунокомпетентных клеток) на миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов у интактных животных. Установлено, что митоген-активированные (ФГА) мононуклеарные клетки вызывают подавление миграции нейтрофильных лейкоцитов. Это свойство характерно для мононуклеарных клеток всех лимфоидных органов, где индекс миграции колебался от 0,73±0,04 до 0,79±0,06. Моноциты иммунных органов, после активации ЛПС, вызывали стимуляцию миграции нейтрофильных лейкоцитов до значений от 1,30±0,06 до 1,34±0,03.

При экспериментальном РГП происходят изменения цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток различных иммунных органов при их активации митогенами ЛПС и ФГА. Эти изменения характеризуются снижением продукции фактора ингибирования миграции нейтрофильных лейкоцитов ФГА-активированными мононуклеарными клетками, ростом стимуляции миграции нейтрофильных лейкоцитов моноцитами, активированными ЛПС E.coli. Полученные данные позволяют полагать, что при экспериментальном перитоните наблюдаются изменения цитокинпродуцирующей активности ИКК, что, по-видимому, приводит к значительному накоплению нейтрофильных лейкоцитов в брюшной полости и участию этих клеток в развитии эккудативно-деструктивного воспаления в ней.

Проведена оценка влияния ронколейкина на функциональное состояние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток венозной крови, Пейеровых бляшек, селезенки и периферических лимфатических узлов в условиях РГП при внутривенном, подкожном и внутрикожном способах введения Ронколейкин (Табл. 1, 2, 3, 4). Как видно из таблиц 1-4, во всех исследуемых органах на протяжении 5-и суток послеоперационного периода происходили значительные изменения миграционной активности нейтрофильных гранулоцитов. В условиях перитонита происходила отмена ингибиции миграции нейтрофильных гранулоцитов ФГА-стимулированными мононуклеарными клетками крови и усиление стимулирующего действия ЛПС-(но не ФГА)-активированными моноцитами на миграцию нейтрофилов во все сроки наблюдения.

У животных, получавших ронколейкин внутривенно, наблюдалось достоверное восстановление ингибиции миграции нейтрофилов крови под воздействием мононуклеарных клеток, активированных ФГА, которое было наиболее характерно для активированных ИКК крови и Пейеровых бляшек, по сравнению с аналогичными клетками периферических лимфоузлов и селезенки. Этот эффект достигал наибольших значений на 5-е сутки послеоперационного периода. При этом следует отметить, что индекс миграции нейтрофилов на 5-е сутки достоверно (p=0,0003) приближался к значениям, полученным у интактных животных (0,77±0,03 и 0,73±0,04, соответственно).

Иммунотропное действие внутривенно вводимого ронколейкина на ЛПС-активированные моноциты отмечалось уже на 1-е сутки послеоперационного периода и сохранялось во все сроки наблюдения. При этом индекс стимуляции миграции нейтрофильных лейкоцитов в крови достиг на 5-е сутки после операции 1,28±0,11 и не отличался от нормы. Следует отметить, что такое действие ронколейкина на функциональную активность ЛПС-акитвированных моноцитов отмечалось у клеток всех исследуемых иммунных органов.

При подкожном введении Ронколейкин оказывал менее выраженное действие на функциональную активность ИКК по сравнению с результатами, полученными при внутривенном введении.

Установлено, что Ронколейкин оказывал выраженное иммунотропное действие при внутрикожном введении. Эффект характеризовался повышением функциональной активности ИКК мононуклеаров при их стимуляции ФГА. В крови наблюдалось достоверное, по сравнению с внутривенным и подкожным способами введения (р=0,0003, р<0,0001 соответственно), восстановление регуляции миграционных свойств нейтрофильных лейкоцитов под влиянием ФГА-активированных мононуклеарных клеток до значений, полученных у здоровых животных. Данный эффект был наиболее характерен для ИКК крови, Пейеровых бляшек и периферических лимфоузлов, но не селезёнки. Кроме этого, следует отметить, что такой иммунотропный эффект отмечался уже на 3-и сутки внутрикожного введения ронколейкина и достигал максимальных значений на 5-е сутки его применения. Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов при этом снижался с 0,97±0,01 до 0,70±0,03 в крови) и с 0,99±0,02 до 0,73±0,01 в Пейеровых бляшках.

При разделении мононуклеаров на лимфоциты и моноциты было установлено, что моноциты всех исследуемых органов после стимуляции ЛПС, но не ФГА, обеспечивали значительное повышение миграции нейтрофильных лейкоцитов во всех исследуемых органах. На фоне применения ронколейкина к 5 суткам послеоперационного периода при всех способах введения достигалось достоверное (внутривенное введение – р=0,006, подкожное – р=0,003, внутрикожное – р=0,001) восстановление миграционных свойств нейтрофилов венозной крови под действием ЛПС-активированных моноцитов до значений, полученных у интактных животных. В то же время, значительных статистически значимых различий выраженности иммунотропного действия ронколейкина на ЛПС-активированные лимфоциты, в зависимости от способа его введения, в эксперименте не выявлено.

Таблица 1

Влияние cпособов введения ронколейкина на функциональную активность митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток крови при экспериментальном распространенном гнойном перитоните