Immunotropic influence of ronkoleukin at different ways of administration at experimental widespread purulent peritonitis

Лечение распространенного гнойного перитонита (РГП) остается одним из наиболее сложных вопросов неотложной хирургии органов брюшной полости. Актуальность и социальная значимость данной проблемы обусловлена ростом числа больных и гнойно-септических осложнений, а также стабильно высоким уровнем летальности [5, 6, 7, 11, 23, 26, 30].

Результаты лечения больных перитонитом определяются не только адекватностью выполненного оперативного вмешательства и полнотой интенсивной терапии послеоперационного периода. Во многом они зависят от состояния иммунной системы пациента и своевременно проводимой коррекции возникающих в ней нарушений [4, 13, 18, 20, 24, 25, 27]. Развитие абдоминального сепсиса с массивной бактериальной токсемией и антигенной гиперстимуляцией системы иммунитета, оперативное вмешательство, антимикробная терапия способствуют развитию комбинированного вторичного иммунодефицита [4, 7, 9, 13, 25, 28]. В условиях РГП происходит быстрое смещение цитокинового профиля в сторону противовоспалительных иммуносупрессорных реакций [12].

Важным звеном в патогенезе иммунной дисфункции является дефицит эндогенного ИЛ-2 [8, 12, 13, 29]. Этот цитокин, продуцируемый Т-лимфоцитами, является одним из ключевых компонентов общей цитокиновой сети, поскольку участвует в формировании адекватной иммунореактивности [8, 13, 31, 32].

Известно, что заместительная иммунокоррекция препаратом рекомбинантного ИЛ-2 «Ронколейкин» при РПГ способствует купированию явлений полиорганной недостаточности и снижению летальности [1-3, 15, 17, 19].

Описаны внутривенный и подкожный способы введения ронколейкина при перитоните, а также использование с данной целью метода экстракорпоральной иммунофармакотерапии [3, 9, 10, 14, 21, 22]. Внутрикожное введение, а также сравнительная оценка эффективности различных способов введения ронколейкина при перитоните в литературе не описаны.

Острая воспалительная реакция в брюшной полости с участием полиморфноядерных нейтрофилов, как клеток первой линии неспецифической иммунной защиты организма от микробной агрессии, играет одну из основных патогенетических ролей в развивающемся на местном и системном уровнях воспалительном ответе, патогенезе сепсиса и полиорганных нарушений у пациентов с РПГ [7, 9, 4, 27, 29]. В связи с этим, изучение влияния способов введения ронколейкина на процессы кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток с клетками острого воспаления в условиях перитонита представляется весьма перспективным.

Цель исследования – изучить иммунокоррегирующее действие ронколейкина на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток иммунных органов при различных способах введения препарата в условиях экспериментального РПГ.

Материалы и методы

Эксперимент выполнен на 70 кроликах-самцах породы шиншилла, массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы: I – норма, n=5; II – 6-ти часовой РГП, n=5; III – контрольная (хирургическое лечение РГП), n=15; IV – хирургическое лечение РГП с внутривенным введением в послеоперационном периоде Ронколейкина, n=15. V – хирургическое лечение распространенного гнойного перитонита с подкожным введением в послеоперационном периоде препарата «Ронколейкин», n=15; VI – хирургическое лечение РГП с внутрикожным введением в послеоперационном периоде Ронколейкина), n=15.

Животные содержались в виварии, в соответствии с международными правилами GLP. Для моделирования РГП использовали микробную взвесь, состоящую из равных количеств аэробов (E.coli, штамм 0111 К58 НИ С 130-53) и анаэробов (B.Fragilis, штамм 323). Микробную взвесь вводили в брюшную полость животных стерильным шприцем из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Через 6 часов после введения микроорганизмов в III, IV, V и VI группах животных с целью лечения перитонита и устранения энтеральной недостаточности выполняли лапаротомию, санацию брюшной полости, декомпрессию тонкой кишки. Животных с РГП выводили из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 часов после заражения и на 1, 3 и 5-е сутки послеоперационного периода.

Животным IV и V групп в послеоперационном периоде (в течение 5-и суток) ежедневно два раза в сутки внутривенно капельно и подкожно соответственно вводили Ронколейкин из расчёта 10 000 МЕ/кг, VI-ой группы – Ронколейкин из расчёта 3 000 МЕ/кг, III группы – эквивалентный объем 0,9%-ного раствора натрия хлорида.

Для иммунологического исследования выполнялся забор венозной крови, селезенки, Пейеровых бляшек и подкожных лимфатических узлов.

Из данных органов готовились клеточные суспензии (107/мл) с использованием культуральной среды (КС), состоящей из среды RPMI-1640 (Sigma, США), 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина и 100 мкг/мл гентамицина. Полученные клеточные суспензии центрифугировались в двойном градиенте раствора фиккола-верографина [25]. Затем мононуклеарные лейкоциты, находящиеся в интерфазном кольце, собирали и дважды отмывали в изотоническом фосфатном буфере. В части исследований мононуклеарные лейкоциты разделяли на лимфоциты и моноциты по способности последних адгезироваться на пластиковой поверхности чашек Петри.

Митогениндуцированная цитокинпродуцирующая активность иммунокомпетентных клеток изучалась в реакции миграции нейтрофильных лейкоцитов (РМЛ) в прямом капиллярном тесте [25]. Для этого, в три ячейки круглодонного планшета для иммунологических исследований вносилось по 0,2 мл суспензии соответствующих иммунокомпетентных клеток. В первую ячейку добавляли 10 мкл фитогемагглютинина (ФГА) (40 мкг/мл), во вторую – 10 мкл липополисахарида (ЛПС) E. Coli (10 мкг/мл), в третью – 10 мкл среды RPMJ-1640. Планшет инкубировали при 370С, 5% СО2 в течение 1,5 часов с последующей элиминацией митогенов путем 2-х кратного центрифугирования при 1000 об/мин в течение 3 минут. К осадку добавляли 0,1 мл (107/мл) суспензии нейтрофильных лейкоцитов (НЛ), приготовленных на культуральной среде. НЛ получали из селезенки кроликов путем центрифугирования в двойном градиенте плотности фиккола-верографина.

Результаты РМЛ выражались в индексе миграции (ИМ), который определяли по формуле:

количество НЛ, мгрировавших из капилляров 
с митотгениндуцированными клетками

количество НЛ, мигрировавших из капилляров
с интактными клетками.

Статистическую обработку данных проводили с использованием электронных пакетов анализа «STATISTICA 6.0» и «Excel». Поскольку распределение признаков носило правильный характер, а дисперсии в сравниваемых группах не отличались, были использованы методы описательной статистики, t-критерий Стьюдента (уровень достоверности отличий средних значений р<0,05).

Результаты и их обсуждение

В первой серии опытов изучалось влияние митоген-индуцированных ИКК (иммунокомпетентных клеток) на миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов у интактных животных. Установлено, что митоген-активированные (ФГА) мононуклеарные клетки вызывают подавление миграции нейтрофильных лейкоцитов. Это свойство характерно для мононуклеарных клеток всех лимфоидных органов, где индекс миграции колебался от 0,73±0,04 до 0,79±0,06. Моноциты иммунных органов, после активации ЛПС, вызывали стимуляцию миграции нейтрофильных лейкоцитов до значений от 1,30±0,06 до 1,34±0,03.

При экспериментальном РГП происходят изменения цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток различных иммунных органов при их активации митогенами ЛПС и ФГА. Эти изменения характеризуются снижением продукции фактора ингибирования миграции нейтрофильных лейкоцитов ФГА-активированными мононуклеарными клетками, ростом стимуляции миграции нейтрофильных лейкоцитов моноцитами, активированными ЛПС E.coli. Полученные данные позволяют полагать, что при экспериментальном перитоните наблюдаются изменения цитокинпродуцирующей активности ИКК, что, по-видимому, приводит к значительному накоплению нейтрофильных лейкоцитов в брюшной полости и участию этих клеток в развитии эккудативно-деструктивного воспаления в ней.

Проведена оценка влияния ронколейкина на функциональное состояние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток венозной крови, Пейеровых бляшек, селезенки и периферических лимфатических узлов в условиях РГП при внутривенном, подкожном и внутрикожном способах введения Ронколейкин (Табл. 1, 2, 3, 4). Как видно из таблиц 1-4, во всех исследуемых органах на протяжении 5-и суток послеоперационного периода происходили значительные изменения миграционной активности нейтрофильных гранулоцитов. В условиях перитонита происходила отмена ингибиции миграции нейтрофильных гранулоцитов ФГА-стимулированными мононуклеарными клетками крови и усиление стимулирующего действия ЛПС-(но не ФГА)-активированными моноцитами на миграцию нейтрофилов во все сроки наблюдения.

У животных, получавших ронколейкин внутривенно, наблюдалось достоверное восстановление ингибиции миграции нейтрофилов крови под воздействием мононуклеарных клеток, активированных ФГА, которое было наиболее характерно для активированных ИКК крови и Пейеровых бляшек, по сравнению с аналогичными клетками периферических лимфоузлов и селезенки. Этот эффект достигал наибольших значений на 5-е сутки послеоперационного периода. При этом следует отметить, что индекс миграции нейтрофилов на 5-е сутки достоверно (p=0,0003) приближался к значениям, полученным у интактных животных (0,77±0,03 и 0,73±0,04, соответственно).

Иммунотропное действие внутривенно вводимого ронколейкина на ЛПС-активированные моноциты отмечалось уже на 1-е сутки послеоперационного периода и сохранялось во все сроки наблюдения. При этом индекс стимуляции миграции нейтрофильных лейкоцитов в крови достиг на 5-е сутки после операции 1,28±0,11 и не отличался от нормы. Следует отметить, что такое действие ронколейкина на функциональную активность ЛПС-акитвированных моноцитов отмечалось у клеток всех исследуемых иммунных органов.

При подкожном введении Ронколейкин оказывал менее выраженное действие на функциональную активность ИКК по сравнению с результатами, полученными при внутривенном введении.

Установлено, что Ронколейкин оказывал выраженное иммунотропное действие при внутрикожном введении. Эффект характеризовался повышением функциональной активности ИКК мононуклеаров при их стимуляции ФГА. В крови наблюдалось достоверное, по сравнению с внутривенным и подкожным способами введения (р=0,0003, р<0,0001 соответственно), восстановление регуляции миграционных свойств нейтрофильных лейкоцитов под влиянием ФГА-активированных мононуклеарных клеток до значений, полученных у здоровых животных. Данный эффект был наиболее характерен для ИКК крови, Пейеровых бляшек и периферических лимфоузлов, но не селезёнки. Кроме этого, следует отметить, что такой иммунотропный эффект отмечался уже на 3-и сутки внутрикожного введения ронколейкина и достигал максимальных значений на 5-е сутки его применения. Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов при этом снижался с 0,97±0,01 до 0,70±0,03 в крови) и с 0,99±0,02 до 0,73±0,01 в Пейеровых бляшках.

При разделении мононуклеаров на лимфоциты и моноциты было установлено, что моноциты всех исследуемых органов после стимуляции ЛПС, но не ФГА, обеспечивали значительное повышение миграции нейтрофильных лейкоцитов во всех исследуемых органах. На фоне применения ронколейкина к 5 суткам послеоперационного периода при всех способах введения достигалось достоверное (внутривенное введение – р=0,006, подкожное – р=0,003, внутрикожное – р=0,001) восстановление миграционных свойств нейтрофилов венозной крови под действием ЛПС-активированных моноцитов до значений, полученных у интактных животных. В то же время, значительных статистически значимых различий выраженности иммунотропного действия ронколейкина на ЛПС-активированные лимфоциты, в зависимости от способа его введения, в эксперименте не выявлено.

Таблица 1

Влияние cпособов введения ронколейкина на функциональную активность митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток крови при экспериментальном распространенном гнойном перитоните