Relative Ability to form Biofilms in Vitro of Staphylococcus Strains Isolated at Implant-Associated Infection and Inflammatory Complications Following Reconstructive Plastic Surgeries

Full Text

Возрастающая актуальность проблемы имплант-ассоциированной инфекции связана с постоянным увеличением количества эндопротезирований крупных суставов и необходимостью изучения патогенеза данного процесса для совершенствования диагностических и лечебных методов [1, 2].
Многими исследователями представителям рода Staphylococcus spp. отводится ведущая роль в этиологии перипротезной инфекции, которая связана с их склонностью к биопленкоообразованию на поверхности имплантатов, генетически детерминированной возможностью синтеза полисахаридного межклеточного адгезина, способствующего формированию многослойных клеточных структур, подавляющих гуморальные и клеточные факторы иммунитета, снижающих эффективность антибиотикотерапии, способствующих хронизации инфекционно-воспалительного процесса [3]. Зарубежные исследователи выделяют отдельные нозологические формы инфекционного процесса, патогенез которого связан с формированием биопленки: «biofilm-associated infections» и «biofilm-related infection» [4]. Формирование стафилококковых биопленок играет важную роль в патогенезе различных инфекционных осложнений в травматологии и ортопедии: остеомиелита, хронической раневой инфекции, однако наиболее важное патогенетическое значение биопленки имеют в развитии инфекций, связанных с эндопротезированием крупных суставов. Главная роль в патогенезе перипротезной инфекции принадлежит склонности бактериальных клеток к колонизации биогенных и абиогенных поверхностей перипротезной области [4, 5].
Изучение роли микробных пленок в развитии инфекционных осложнений после хирургических вмешательств различного типа и участия в формировании биопленок видов стафилококка может способствовать разработке новых подходов к диагностике имплант-ассоциированной инфекции, оптимизации этиотропной терапии и повышению эффективности лечения пациента.
Цель
Изучить способность к пленкобразованию in vitro штаммов Staphylococcus spp., выделенных при инфекционных осложнениях после эндопротезирования крупных суставов и реконструктивно-пластических операций в травматологии и ортопедии.
Материалы и методы
Проанализированы результаты микробиологического исследования биологического материала, полученного от 72-х пациентов с инфекционными осложнениями после хирургических вмешательств травматолого-ортопедического профиля, обусловленными S. aureus и S. epidermidis (средний возраст пациентов составил 59,8±7,2 года, мужчин было 34,5%, женщин 65,6%), проходивших лечение в НИИТОН СГМУ им. В.И. Разумовского в 2016-2018 гг. Типы хирургических вмешательств, способствующих впоследствие развитию инфекционно-воспалительных осложнений, представлены в таблице 1.
В исследование включены 38 штаммов Staphylococcus spp., выделенных у пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией (группа 1), и 34 штамма стафилококка (группа 2) от пациентов с инфекционно-воспалительными осложнениями после реконструктивно-пластических операций. Видовой состав микроорганизмов в обеих группах представлен в таблице 2.
Группу сравнения составили референс-штаммы S.epidermidis (АТСС 12228) и S.aureus (АТСС 25923, MRSA 43300).
Взятие биологического материала из ран, свищей, аспирата из полости сустава осуществляли на этапе дооперационной диагностики, затем непосредственно помещали в жидкие и твердые питательные среды.
На этапе интраоперационной диагностики 3-5 биоптатов мягких тканей периартикулярной области помещали в одноразовый стерильный контейнер, взвешивали, гомогенизировали, готовили десятикратные разведения биоматериала, мерно высевали на плотные питательные среды для количественного исследования.
Для деструкции микробной пленки с целью получения взвеси сессильных микробных клеток проводили обработку компонентов эндопротеза в стерильном пакете с 50-100 мл раствора 0,9% NaCl в УЗ-установке «УЗУМИ-2» при частоте 37 кГЦ 10 минут, после чего соникационную жидкость высевали для культурального исследования.
Проведение микробиологического исследования регламентировалось Приказом МЗ СССР №535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Идентификацию микроорганизмов осуществляли с помощью анализатора Crystal AutoReader (Becton Dickinson) и панелей Crystal Gram-Positive. Суспензию микроорганизмов с определенной концентрацией готовили с помощью прибора Densi-La-Meter (Pliva-Lachema Diagnostika, Чехия). Антибиотикочувствительность определяли диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» на агаре Mueller-Hinton (Becton Dickinson). Набор «MeReSa Agar Base, MRSA Alert» (Hi Media, Индия) использовали для выявления резистентности к метициллину.
Способность к биопленкообразованию изучали количественным методом оценки адгезивной активности и определения биомассы биопленки, разработанным G.D.Christensen [6]. В лунки стерильных полистироловых микротитровальных планшетов помещали суспензию суточных штаммов стафилококка в концентрации 5×106 КОЕ/мл по 100 мкл, затем добавляли по 100 мкл ГРМ-бульона с глюкозой, инкубировали в течение 48 ч при 37°С. После инкубации удаляли культуральную жидкость с планктонной формой бактерий, лунки промывали трехкратно 0,9% раствором хлорида натрия. После этого в лунки добавляли по 200 мкл раствора 0,1% генцианвиолета и оставляли на 30 мин при комнатной температуре для связывания красителя с матриксом биопленки. Промывкой дистиллированной водой удаляли краситель, который не связался с биомассой пленки. Для растворения генцианвиолета, связавшегося на стенках полистироловых лунок с клетками биопленок, добавляли по 200 мкл 95% этанола на 10 минут при комнатной температуре. Количественную оценку оптической плотности полученных спиртовых элюатов генцианового виолетового проводили на микропланшетном спектрофотометре (Anthos 2020, Австрия) при длине волны 620 нм.
Для контроля в часть лунок добавляли жидкую питательную среду без бактерий, затем последовательность манипуляций была аналогичной опытным лункам.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 10.0. Использовали непараметрические методы исследования с вычислением медианы (Me), 25‑го и 75‑го квартилей (Q). Для сравнения трех выборок использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты и их обсуждение
У штаммов S.epidermidis, полученных от пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией, величина оптической плотности экстрактов красителя составила 0,423 (0,318; 0,499), что отражает высокую интенсивность формирования биопленки. У штаммов второй группы (пациенты с инфекционным осложнениями реконструктивно-пластических операций) оптическая плотность экстрактов красителя была достоверно (р=0,002383) ниже по отношению к первой группе и составила 0,101 (0,074; 0,178) что свидетельствует о том, что их способность к пленкообразованию была ниже.
Оптическая плотность экстрактов красителей у референс-штаммы S.epidermidis (АТСС 12228) составила 0,056 (0,031; 0,074), что также свидетельствует о слабой способности к пленкообразованию, показатели оптической плотности референс-штаммов статистически достоверно (р=0,000001) отличалась от штаммов первой группы; достоверных отличий показателей оптической плотности референс-штаммов от значений оптической плотности штаммов второй группы не было, что отражено на рисунке 1.
Также проведено исследование способности к формированию биопленок штаммами S.aureus. У штаммов, выделенных из биологического материала пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией (группа 1) значения оптической плотности экстрактов кристаллического фиолетового составили 0,788 (0,623; 0,943), что характерно для высокой способности к формированию биопленок. Оптическая плотность экстрактов красителя, полученных из клинических штаммов S.aureus, изолированных от пациентов с инфекционно-воспалительными осложнениями реконструктивно-пластических операций (2 группа) составила 0,198 (0,127; 0,272) и была достоверно ниже (р=0,001323) по отношению к первой группе. Оптическая плотность экстрактов красителей референтных штаммов S.aureus составила 0,055 (0,047; 0,072), что свидетельствовало о слабой способности к образованию биопленок, показатели оптической плотности референс-штаммов были достоверно ниже (p<0,05), чем у обеих групп клинических штаммов, что представлено на рисунке 2.
Проведен сравнительный межвидовой анализ способности S.epidermidis и S.aureus формировать биопленки, который показал, что среди штаммов, выделенных при имплант-ассоциированной инфекции, наблюдались статистически достоверные (p=0,001765) отличия: штаммы S.aureus демонстрировали большую склонность к пленкообразованию, чем коагулазонегативные стафилококки.
Среди группы штаммов, выделенных от пациентов с инфекционными осложнениями после реконструктивно-пластических операций на костях конечностей (группа 2), видовых различий в способности к биопленкообразованию выявлено не было. Оптическая плотность экстрактов генцианвиолета, полученного из штаммов S. epidermidis, достоверно не отличалась от оптической плотности элюэнтов, полученных из штаммов S. aureus. В таблице 3 представлены показатели оптической плотности клинических штаммов коагулазоположительных и коагулазоотрицательных штаммов, выделенных из биологического материала обеих групп пациентов.
Таким образом, в результате исследования установлено, что как коагулазоположительные, так и коагулазонегативные штаммы, выделенные из биологического материала пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией, обладают выраженной склонностью к образованию биопленок, что является одним из главных патогенетических механизмов перипротезной инфекции. Способность к биопленкообразованию у штаммов S.aureus, выделенных при имплант-ассоцированной инфекции, была достоверно выше (p<0,05), чем у коагулазонегативных стафилококков.
Штаммы Sthaphylococcus spp., выделенные из биологического материала пациентов с инфекционными осложнениями после реконструктивно-пластических операций, обладали достоверно (p<0,05) меньшей способностью к биопленкообразованию, чем клинические штаммы первой группы и достоверных межвидовых различий среди этой группы выявлено не было.
Представители рода Staphylococcus признаны наиболее актуальными возбудителями инфекционных осложнений при эндопротезировании крупных суставов [1, 7]. До последнего десятилетия представителям S. aureus уделялось особенно пристальное внимание исследователей в связи с наличием большого количества факторов вирулентности и патогенности, частым развитием полирезистентности [1, 2], однако в последнее время изменились взгляды исследователей на роль коагулазонегативных стафилококков, которые ранее рассматривались как коммерсалы с минимальным набором фактором вирулентности. В ряде исследований показана способность S. epidermidis формировать биопленки, являющиеся важным фактором патогенности и основным звеном патогенеза развития перипротезной инфекции в травматологии и ортопедии [8-10].
Проведенный сравнительный анализ способности штаммов стафилококка к биопленкообразованию в зависимости типа хирургического вмешательства, приведшего к инфекционному осложнению, и вида стафилококка, показал, что штаммы как коагулазоположительных, так и коагулазоотрицательных стафилококков, выделенные при имплант-ассоциированной инфекции, характеризуются более выраженной способностью к биопленкообразованию, чем штаммы Staphylococcus spp., выделенные из биоматериала пациентов с инфекционными осложнениями реконструктивно-пластических операций на костях конечностей.
Заключение
Изучение способности возбудителей инфекционных осложнений к биопленкообразованию имеет большое практическое значение в травматологии и ортопедии. Инфекционные осложнения после эндопротезирования крупных суставов часто вызываются пленкообразующими штаммами стафилококка, что меняет методологический подход к микробиологической диагностике данной патологии и требует пересмотра этиотропной терапии.

About the authors

Irina Vladimirovna Babushkina

 Scientific Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery of Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky

Author for correspondence.
Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6740-1050
SPIN-code: 8777-6795
Scopus Author ID: 9839149200
ResearcherId: A-7584-2018

Cand. Med. Sci., Senior Research Assistant of the Fundamental, Clinical and Experimental Research Department in Scientific Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery of Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky

Russian Federation, Russian Federation, Saratov, 410002, 148 Chernyshevskogo str.

Vladimir Yurievich Ulyanov

Scientific Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery of Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky

Email: sartiito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9466-8348
SPIN-code: 8280-3339

Dr. Med. Sci, deputy director for Science and Innovations

Russian Federation, Russian Federation, Saratov, 410002, 148 Chernyshevskogo str.

Aleksandr Sergeevich Bondarenko

Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky

Email: sarniito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6345-1851
SPIN-code: 6719-4520

Vice-Dean of General Medicine Department and Clinical Psychology Department

Russian Federation,  Russian Federation, Saratov, 410012, Bolshaya Kazachya str., 112.  

Irina Alexandrovna Mamonova

Scientific Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery of Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky

Email: sarniito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3941-4334
SPIN-code: 7957-2955

Cand. Biol. Sci., Junior Research Assistant of the Fundamental, Clinical and Experimental Research Department

Russian Federation, Russian Federation, Saratov, 410002, 148 Chernyshevskogo str.

References

Supplementary files