Сравнительная способность к формированию биопленок in vitro штаммами стафилококка, выделенными при имплантат-ассоциированной инфекции и воспалительных осложнениях реконструктивно-пластических операций

Полный текст

Возрастающая актуальность проблемы имплант-ассоциированной инфекции связана с постоянным увеличением количества эндопротезирований крупных суставов и необходимостью изучения патогенеза данного процесса для совершенствования диагностических и лечебных методов [1, 2].
Многими исследователями представителям рода Staphylococcus spp. отводится ведущая роль в этиологии перипротезной инфекции, которая связана с их склонностью к биопленкоообразованию на поверхности имплантатов, генетически детерминированной возможностью синтеза полисахаридного межклеточного адгезина, способствующего формированию многослойных клеточных структур, подавляющих гуморальные и клеточные факторы иммунитета, снижающих эффективность антибиотикотерапии, способствующих хронизации инфекционно-воспалительного процесса [3]. Зарубежные исследователи выделяют отдельные нозологические формы инфекционного процесса, патогенез которого связан с формированием биопленки: «biofilm-associated infections» и «biofilm-related infection» [4]. Формирование стафилококковых биопленок играет важную роль в патогенезе различных инфекционных осложнений в травматологии и ортопедии: остеомиелита, хронической раневой инфекции, однако наиболее важное патогенетическое значение биопленки имеют в развитии инфекций, связанных с эндопротезированием крупных суставов. Главная роль в патогенезе перипротезной инфекции принадлежит склонности бактериальных клеток к колонизации биогенных и абиогенных поверхностей перипротезной области [4, 5].
Изучение роли микробных пленок в развитии инфекционных осложнений после хирургических вмешательств различного типа и участия в формировании биопленок видов стафилококка может способствовать разработке новых подходов к диагностике имплант-ассоциированной инфекции, оптимизации этиотропной терапии и повышению эффективности лечения пациента.
Цель
Изучить способность к пленкобразованию in vitro штаммов Staphylococcus spp., выделенных при инфекционных осложнениях после эндопротезирования крупных суставов и реконструктивно-пластических операций в травматологии и ортопедии.
Материалы и методы
Проанализированы результаты микробиологического исследования биологического материала, полученного от 72-х пациентов с инфекционными осложнениями после хирургических вмешательств травматолого-ортопедического профиля, обусловленными S. aureus и S. epidermidis (средний возраст пациентов составил 59,8±7,2 года, мужчин было 34,5%, женщин 65,6%), проходивших лечение в НИИТОН СГМУ им. В.И. Разумовского в 2016-2018 гг. Типы хирургических вмешательств, способствующих впоследствие развитию инфекционно-воспалительных осложнений, представлены в таблице 1.
В исследование включены 38 штаммов Staphylococcus spp., выделенных у пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией (группа 1), и 34 штамма стафилококка (группа 2) от пациентов с инфекционно-воспалительными осложнениями после реконструктивно-пластических операций. Видовой состав микроорганизмов в обеих группах представлен в таблице 2.
Группу сравнения составили референс-штаммы S.epidermidis (АТСС 12228) и S.aureus (АТСС 25923, MRSA 43300).
Взятие биологического материала из ран, свищей, аспирата из полости сустава осуществляли на этапе дооперационной диагностики, затем непосредственно помещали в жидкие и твердые питательные среды.
На этапе интраоперационной диагностики 3-5 биоптатов мягких тканей периартикулярной области помещали в одноразовый стерильный контейнер, взвешивали, гомогенизировали, готовили десятикратные разведения биоматериала, мерно высевали на плотные питательные среды для количественного исследования.
Для деструкции микробной пленки с целью получения взвеси сессильных микробных клеток проводили обработку компонентов эндопротеза в стерильном пакете с 50-100 мл раствора 0,9% NaCl в УЗ-установке «УЗУМИ-2» при частоте 37 кГЦ 10 минут, после чего соникационную жидкость высевали для культурального исследования.
Проведение микробиологического исследования регламентировалось Приказом МЗ СССР №535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Идентификацию микроорганизмов осуществляли с помощью анализатора Crystal AutoReader (Becton Dickinson) и панелей Crystal Gram-Positive. Суспензию микроорганизмов с определенной концентрацией готовили с помощью прибора Densi-La-Meter (Pliva-Lachema Diagnostika, Чехия). Антибиотикочувствительность определяли диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» на агаре Mueller-Hinton (Becton Dickinson). Набор «MeReSa Agar Base, MRSA Alert» (Hi Media, Индия) использовали для выявления резистентности к метициллину.
Способность к биопленкообразованию изучали количественным методом оценки адгезивной активности и определения биомассы биопленки, разработанным G.D.Christensen [6]. В лунки стерильных полистироловых микротитровальных планшетов помещали суспензию суточных штаммов стафилококка в концентрации 5×106 КОЕ/мл по 100 мкл, затем добавляли по 100 мкл ГРМ-бульона с глюкозой, инкубировали в течение 48 ч при 37°С. После инкубации удаляли культуральную жидкость с планктонной формой бактерий, лунки промывали трехкратно 0,9% раствором хлорида натрия. После этого в лунки добавляли по 200 мкл раствора 0,1% генцианвиолета и оставляли на 30 мин при комнатной температуре для связывания красителя с матриксом биопленки. Промывкой дистиллированной водой удаляли краситель, который не связался с биомассой пленки. Для растворения генцианвиолета, связавшегося на стенках полистироловых лунок с клетками биопленок, добавляли по 200 мкл 95% этанола на 10 минут при комнатной температуре. Количественную оценку оптической плотности полученных спиртовых элюатов генцианового виолетового проводили на микропланшетном спектрофотометре (Anthos 2020, Австрия) при длине волны 620 нм.
Для контроля в часть лунок добавляли жидкую питательную среду без бактерий, затем последовательность манипуляций была аналогичной опытным лункам.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 10.0. Использовали непараметрические методы исследования с вычислением медианы (Me), 25‑го и 75‑го квартилей (Q). Для сравнения трех выборок использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты и их обсуждение
У штаммов S.epidermidis, полученных от пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией, величина оптической плотности экстрактов красителя составила 0,423 (0,318; 0,499), что отражает высокую интенсивность формирования биопленки. У штаммов второй группы (пациенты с инфекционным осложнениями реконструктивно-пластических операций) оптическая плотность экстрактов красителя была достоверно (р=0,002383) ниже по отношению к первой группе и составила 0,101 (0,074; 0,178) что свидетельствует о том, что их способность к пленкообразованию была ниже.
Оптическая плотность экстрактов красителей у референс-штаммы S.epidermidis (АТСС 12228) составила 0,056 (0,031; 0,074), что также свидетельствует о слабой способности к пленкообразованию, показатели оптической плотности референс-штаммов статистически достоверно (р=0,000001) отличалась от штаммов первой группы; достоверных отличий показателей оптической плотности референс-штаммов от значений оптической плотности штаммов второй группы не было, что отражено на рисунке 1.
Также проведено исследование способности к формированию биопленок штаммами S.aureus. У штаммов, выделенных из биологического материала пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией (группа 1) значения оптической плотности экстрактов кристаллического фиолетового составили 0,788 (0,623; 0,943), что характерно для высокой способности к формированию биопленок. Оптическая плотность экстрактов красителя, полученных из клинических штаммов S.aureus, изолированных от пациентов с инфекционно-воспалительными осложнениями реконструктивно-пластических операций (2 группа) составила 0,198 (0,127; 0,272) и была достоверно ниже (р=0,001323) по отношению к первой группе. Оптическая плотность экстрактов красителей референтных штаммов S.aureus составила 0,055 (0,047; 0,072), что свидетельствовало о слабой способности к образованию биопленок, показатели оптической плотности референс-штаммов были достоверно ниже (p<0,05), чем у обеих групп клинических штаммов, что представлено на рисунке 2.
Проведен сравнительный межвидовой анализ способности S.epidermidis и S.aureus формировать биопленки, который показал, что среди штаммов, выделенных при имплант-ассоциированной инфекции, наблюдались статистически достоверные (p=0,001765) отличия: штаммы S.aureus демонстрировали большую склонность к пленкообразованию, чем коагулазонегативные стафилококки.
Среди группы штаммов, выделенных от пациентов с инфекционными осложнениями после реконструктивно-пластических операций на костях конечностей (группа 2), видовых различий в способности к биопленкообразованию выявлено не было. Оптическая плотность экстрактов генцианвиолета, полученного из штаммов S. epidermidis, достоверно не отличалась от оптической плотности элюэнтов, полученных из штаммов S. aureus. В таблице 3 представлены показатели оптической плотности клинических штаммов коагулазоположительных и коагулазоотрицательных штаммов, выделенных из биологического материала обеих групп пациентов.
Таким образом, в результате исследования установлено, что как коагулазоположительные, так и коагулазонегативные штаммы, выделенные из биологического материала пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией, обладают выраженной склонностью к образованию биопленок, что является одним из главных патогенетических механизмов перипротезной инфекции. Способность к биопленкообразованию у штаммов S.aureus, выделенных при имплант-ассоцированной инфекции, была достоверно выше (p<0,05), чем у коагулазонегативных стафилококков.
Штаммы Sthaphylococcus spp., выделенные из биологического материала пациентов с инфекционными осложнениями после реконструктивно-пластических операций, обладали достоверно (p<0,05) меньшей способностью к биопленкообразованию, чем клинические штаммы первой группы и достоверных межвидовых различий среди этой группы выявлено не было.
Представители рода Staphylococcus признаны наиболее актуальными возбудителями инфекционных осложнений при эндопротезировании крупных суставов [1, 7]. До последнего десятилетия представителям S. aureus уделялось особенно пристальное внимание исследователей в связи с наличием большого количества факторов вирулентности и патогенности, частым развитием полирезистентности [1, 2], однако в последнее время изменились взгляды исследователей на роль коагулазонегативных стафилококков, которые ранее рассматривались как коммерсалы с минимальным набором фактором вирулентности. В ряде исследований показана способность S. epidermidis формировать биопленки, являющиеся важным фактором патогенности и основным звеном патогенеза развития перипротезной инфекции в травматологии и ортопедии [8-10].
Проведенный сравнительный анализ способности штаммов стафилококка к биопленкообразованию в зависимости типа хирургического вмешательства, приведшего к инфекционному осложнению, и вида стафилококка, показал, что штаммы как коагулазоположительных, так и коагулазоотрицательных стафилококков, выделенные при имплант-ассоциированной инфекции, характеризуются более выраженной способностью к биопленкообразованию, чем штаммы Staphylococcus spp., выделенные из биоматериала пациентов с инфекционными осложнениями реконструктивно-пластических операций на костях конечностей.
Заключение
Изучение способности возбудителей инфекционных осложнений к биопленкообразованию имеет большое практическое значение в травматологии и ортопедии. Инфекционные осложнения после эндопротезирования крупных суставов часто вызываются пленкообразующими штаммами стафилококка, что меняет методологический подход к микробиологической диагностике данной патологии и требует пересмотра этиотропной терапии.

Об авторах

Ирина Владимировна Бабушкина

НИИ травматологии, ортопедии и нейрохирургии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6740-1050
SPIN-код: 8777-6795
Scopus Author ID: 9839149200
ResearcherId: A-7584-2018

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований

Россия, 410002, Россия, Саратов, ул. Чернышевского, 148

Владимир Юрьевич Ульянов

Научно-исследовательский институт травматологии, ортопедии и нейрохирургии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского

Email: sartiito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9466-8348
SPIN-код: 8280-3339

Доктор медицинских наук, заместитель директора по научной и инновационной деятельности

Россия, 410002, Россия, Саратов, ул.Чернышевского,148

Александр Сергеевич Бондаренко

 Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского

Email: sarniito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6345-1851
SPIN-код: 6719-4520

Заместитель декана лечебного факультета и факультета клинической психологии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И.Разумовского

Россия, 410012, Россия, Саратов, ул.Б. Казачья, 112

Ирина Александровна Мамонова

Научно-исследовательский институт травматологии, ортопедии и нейрохирургии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского

Email: sarniito@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3941-4334
SPIN-код: 7957-2955

Кандидат биологических наук, младший научный сотрудник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований

Россия, 410002, Россия, ул.Чернышевского, 148

Список литературы

Дополнительные файлы