Оптимизация терапевтического ангиогенеза при экспериментальной язвенно-некротической стадии критической ишемии нижних конечностей

Полный текст

Введение. Реакцией организма на ишемию тканей является создание нового микроциркуляторного русла, которое описывается в литературе как неоангиогенез. Чем быстрее образуется новая сеть, тем меньше будет площадь некроза, тем быстрее восстановится функция органа [1]. Неоангиогенез развивается постепенно. В течение первого месяца появляются единичные новые капилляры, а для развития микроциркуляторного русла, включающего артериолы, капилляры, венулы и артериовенозные шунты требуется шесть-двенадцать месяцев [2]. Целью терапевтического ангиогенеза является ускорение образования новой сосудистой сети. Проведенные раннее исследования показали, что наибольшей эффективностью обладают мононуклеарные клетки аутологичного костного мозга. Введение этих клеток в ишемизированные мышцы позволяет сократить в два раза срок создания нового микроциркуляторного русла [3]. Однако, в условиях критической ишемии нижних конечностей этот срок является слишком длительным: конечность не удается спасти в большинстве случаев [4, 5].

Повысить эффективность терапевтического неоангиогенеза позволяет применение фармакологических препаратов, обладающих выраженным перфузионным эффектом, чем выше перфузия ишемизированных тканей, тем быстрее развивается новое микроциркуляторное русло [6]. В последние годы в клинической практике для лечения перемежающей хромоты, возникающий при хронической ишемии нижних конечностей на фоне облитерирующих заболеваний артерий, стал широко применяться новый лекарственный препарат «Цилостозол»,который является ингибитором фосфодиэстеразы (ФЭД)-3 и обладает выраженным вазодилятирующим эффектом. В организме человека существует 11 типов фосфодиэстеразы. Блокируя тот или иной тип лекарственным препаратом можно добиться нужного эффекта: вызвать бронходилятацию, вазодилятацию, устранить эректильную дисфункцию у мужчин, острую сердечную недостаточность и др. [7].

ФЭД-5 содержится в эндотелиальных клетках стенок сосудов, а ее ингибиторы (уденафил, синденафил)  обладают вазодилятирующим действием и применяются в клинической практике для устранения эректильной дисфункции у мужчин, путем увеличения притока крови в половой член  во время сексуального возбуждения [8]. Поэтому можно предположить, что ингибиторы ФЭД-5 как и ингибиторы ФЭД-3 должны оказывать положительное влияние на течение хронической ишемии конечности. Возрастание перфузии ишемизированных тканей, в свою очередь, может повысить эффективность клеточной терапии.

Цель. Изучить эффективность терапевтического ангиогенеза препаратом «Уденафил», мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга и их комбинацией при экспериментальной язвенно-некротической стадии критической ишемии нижних конечностей.

Материалы и методы

Эксперименты проводили на крысах линии Wistar в возрасте 4 месяцев, массой 220–250 г, прошедших карантин в условиях вивария НИИ экспериментальной медицины Курского государственного медицинского университета. Протокол исследования соответствовал этическим принципам и нормам проведения биомедицинских исследований с участием животных. Наркотизацию животных осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса, выведение из эксперимента - его передозировкой. Животных распределили по группам путем рандомизации со стратификацией по массе тела, а также по проводимым операциям и манипуляциям. Были сформированы следующие группы:  животные с ишемией конечности, не получавшие лечения (контрольная группа, n = 20);животные с ишемией мышц конечности, получавшие уденафил (первая опытная группа, n = 20); животные с ишемией конечности, получавшие мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга (вторая опытная группа,n = 20);животные с ишемией конечности, получавшие уденафил в комбинации с мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга (третья опытная группа, n = 20)

Оригинальный способ создания язвенно-некротической стадии ишемии конечностей в контрольной группе подробно описан нами ранее и заключался в иссечении  бедренной, подколенной и берцовых артерий и вен,пересечении периферического нерва[ 9].

В первой опытной группе после моделирования критической ишемии перорально вводили уденафил 8,6 мг/кг в течение 28 дней. Во второй опытной группе на фоне моделирования критической ишемии производили ее коррекцию мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.На7 сутки эксперимента после развития клинической картины язвенно-некротической стадии критической ишемии производили пункцию большеберцовой кости и аспирировали 1-2 мл клеток костного мозга..Мононуклеарную фракцию выделяли по методу Boyum [10] Однократно  введили  по 50 мкл мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга  в 2 точки:паравазально над  и под паховой связкой в места функционирующих ветвей подвздошной артерии,которые кровоснабжают мышцы верхней и средней трети бедра.  и в 2 точки  в ишемизированные мышцы нижней трети внутренней поверхности бедра и задней поверхности голени. .Введение аутоклеток костного мозга осуществляли по ходу функционирующих сосудов и в ишемизированные мышцы для создания новых путей притока артериальной крови.

В третьей опытной группе коррекция критической ишемии производилась комбинацией уденафила перорально в дозе 0,86 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 28дней и однократным  введением мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга, аналогично второй опытной группе животных.

Уровень микроциркуляции крови в мышцах голени определяли на 21 и 28-е сутки при помощи лазерной допплеровской флоуметрии, значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ).Предварительно перед началом эксперимента нами был определен у интактных животных нормальный уровень микроциркуляции в мышцах голени ,который оказался равным 531,86±12.08 ПЕ.

Животных выводили из эксперимента на 21 и 28-е сутки (по 10 крыс в каждый срок) путем передозировки наркоза. В каждом случае производили аутопсию с дальнейшей подготовкой препарата мышцы голени. Гистологический материал фиксировали в 10 % формалине в течение 7 сут. Парафиновые блоки и микропрепараты изготавливали по стандартной методике.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel 10.0. Рассчитывали средние значения (M) показателей и ошибки среднего (m). Использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями для сравнения показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при p <0,05.

 

Результаты и их обсуждение

 

Оценка уровня микроциркуляции в группа у экспериментальных животных представлена в таблице 1.

Таблица 1. Результаты оценки уровня микроциркуляции в мышцах голени у экспериментальных животных, (M±m) в перфузионных единицах

Table 1. Results of the assessment of the level of microcirculation in the muscles of the lower leg in experimental animals, (M±m) in perfusion unitsм

Группа животных/ Group of animals	21 сутки/21 days (n=10)	28 сутки/28 days(n=10)
Контрольная (моделирование критической ишемии)/ Control (modeling of critical ischemia)	249,1±7,31*	302,9±6,46*
1опытная(моделирование критической ишемии и ее коррекция уденафилом)/ 1 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil)	394,6±5,99*   **	486,7±7,59*   **
2опытная (моделирование критической ишемии и ее коррекция мононуклеарной фракцией костного мозга)/ 2 experimental (modeling of critical ischemia and its correction of the bone marrow mononuclear fraction)	401,3±10,87*   **	504,8±8,52*   **
3опытная (моделирование критической ишемии и ее коррекция уденафилом и мононуклеарной фракцией костного мозга)/ 3 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil and bone marrow mononuclear fraction) 3 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil and bone marrow mononuclear fraction)	451,9±19,8*  **  ***	543,4±11,25**   ***

Примечание: * - p<0,05 в сравнении с интактными животными; ** - p <0,05 в сравнении с контрольной группой; *** - p<0,05 в сравнении с первой  и второй опытными группами.

Note: * - p<0.05 in comparison with intact animals; * * - p <0.05 in comparison with the control group; *** - p<0.05 in comparison with the first and second experimental groups.

 

. В контрольной группе уровень регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс стал меньше чем в группе интактных животных на 21-е сутки в 2,1 раза и на 28-е сутки в 1,8 раза. В 1опытной группе после введения животным уденафила регионарный кровоток увеличивался на 21-е и на 28-е сутки в 1,6 раза, по сравнению с контрольной  группой животных. Во 2опытной группе при введении животным мононуклеарной фракции костного мозга кровоток увеличился соответственно в 1,6 раза и 1,7 раза. В 3опытной группе после комбинированного применения клеток костного мозга и уденафила регионарный кровоток возрастал на 21-е и на 28-е - 1,8 раза

На 28-е сутки в контрольной группе животных с критической ишемией в пораженных мышцах наблюдалась картина тяжелого воспалительного процесса.. Визуализировались общирные участки некротизированных тканей,которые были инфильтрированы нейтрофилами и лимфоцитами.В прилегающей к участкам некроза мышечной ткани определялись  атрофированные  волокна.. В  соединительнотканных прослойках гистологические признаки воспалительного процесса были менее выраженными.  Визуализировались как клетки воспалительного ряда (лимфоциты, моноциты, тучные , нейтрофилы и эозинофилы),так и клетки репаративного- единичные фибробласты и фиброциты. В окружности мышцы был выраженный интерстициальный отек, появлялись  новые единичные капилляры .. ( рисунок 1А).

   

А/A                             Б/B                             В/C                             Г/D

 

Рис. 1 Микрофотография среза скелетной мышечной ткани в области средней трети голени у крыс на 28-е сутки эксперимента. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х400. А – мышцы голени крыс контрольной группы; Б – ишемизированные мышцы голени крыс, получавших уденафил; В - ишемизированные мышцы голени крыс после введения мононуклеарной фракции костного мозга; Г - ишемизированные мышцы голени крыс, получавших уденафил в комбинации с мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.

Fig. 1 Micrograph of a section of skeletal muscle tissue in the middle third of the lower leg in rats on the 28th day of the experiment. Stained with hematoxylin and eosin. Uv. x400. A – lower leg muscles of rats of the control group; B – ischemic lower leg muscles of rats treated with udenafil; C - ischemic lower leg muscles of rats after administration of the mononuclear fraction of bone marrow; D - ischemic lower leg muscles of rats treated with udenafil in combination with the mononuclear fraction of autologous bone marrow.

При гистологическом исследовании мышечной ткани в первой опытной группе обнаружена положительная динамика. Во-первых, участки некроза начали ограничиваться и замещаться грануляционной тканью. Изменилось соотношение клеточного компонента в сторону преобладания клеток репаративного над клетками воспалительного ряда. Во-вторых, вблизи участков некроза появились многочисленные вновь образованные капилляры Однако в прослойках соединительной ткани между скелетными мышцами сохранялась клеточная инфильтрация, что свидетельствовало о незавершенности воспалительного процесса. (рисунок 1Б).

При микроскопии у животных во второй опытной группе после введения мононуклеарных клеток костного мозга, также, как и в первой опытной группе, выявлено снижение степени воспалительного процесса, что проявлялось уменьшением количества и размеров некротических участков, замещением их молодой соединительной тканью. Продолжала сохраняться круглоклеточная инфильтрация. В прослойках соединительной ткани  регистрироваться клеточные элементы воспалительного процесса. Артериолы и венулы, вокруг очагов некроза были расширены с признаками тромбоза. Как и у животных первой группы определялись многочисленные новообразованные капилляры. Однако. единого микроциркуляторного русла не образовалось (рисунок 1В).

Степень выраженности некротических изменений в группе, получавшей комбинированное лечение уденафилом и мононуклеарной фракцией костного мозга, была минимальной, среди всех групп наблюдения. Симпласты мышечных волокон имели однородную окраску саркоплазмы. При визуализации под большим увеличением, как на поперечных, так и на продольных срезах определялись мелкие вытянутой формы расположенные по периферии мышечных волокон ядра. В прослойках соединительной ткани плотность клеток была низкая, в поле зрения преобладали клетки фибробластического дифферона. Определялись единичные лимфоциты, мелкие тучные клетки, преимущественно в стадии накопления секрета. Артериолы и венулы, наполнены кровью, без признаков структурных нарушений. В широких прослойках соединительной ткани (в участках между мышц, где изначально локализовались крупные сосуды) визуализировалось большое количество новообразованных кровеносных сосудов с признаками тромбоза. Определялись вновь сформированные.артериолы и венулы.которые вместе с капиллярами создавали  единую сеть.. В стенке сосудов определялись плоские эндотелиоциты , ось клетки ориентирована вдоль базальной мембраны, мышечная оболочка образована гладкими миоцитами, без признаков фиброза. Можно считать что у животных этой группы сформировалось новое микроциркуляторное русло(рисунок1Г).

 

Проведенное исследование показало, что ингибитор фосфодиэстеразы-5уденофил улучшает перфузию ишемизированных тканей и тем самым предотвращает распространение некротического процесса. Уденафил так же способствует образованию новых капилляров, но эффективность его не достаточна ,чтобы  вызвать полноценный ангиогенез.

Изолированное введение аутологичных клеток костного мозга позволяет ограничить очаги некроза соединительной тканью и увеличить перфузию ишемизированных мышц. Однако, новое микроциркуляторное русло к концу эксперимента оказалось не сфоримированным. Лишь при комбинированном применении уденафила и мононуклеарной фракции костного мозга к концу эксперимента в ишемизированных тканях сформировалось новое микроциркуляторное русло.

 Основной причиной неудач клеточной терапии в стадии критической ишемии нижних конечностей является недостаточная перфузия ишемизированных тканей. Поэтому применение ингибиторов фосфодиэстеразы -5 , обладающих вазодилятирующим действием,в лечении сердечно-сосудистых заболеваний  является вполне оправданным [11]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 Комбинированное применение при экспериментальной ишемии конечности уденафила и мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга позволяет в 1,8 раза увеличить перфузию ишемизированных тканей и сформировать новое микроциркуляторное русло.

 

Дополнительная информация

 

Конфликт интересов

Авто

Введение. Реакцией организма на ишемию тканей является создание нового микроциркуляторного русла, которое описывается в литературе как неоангиогенез. Чем быстрее образуется новая сеть, тем меньше будет площадь некроза, тем быстрее восстановится функция органа [1]. Неоангиогенез развивается постепенно. В течение первого месяца появляются единичные новые капилляры, а для развития микроциркуляторного русла, включающего артериолы, капилляры, венулы и артериовенозные шунты требуется шесть-двенадцать месяцев [2]. Целью терапевтического ангиогенеза является ускорение образования новой сосудистой сети. Проведенные раннее исследования показали, что наибольшей эффективностью обладают мононуклеарные клетки аутологичного костного мозга. Введение этих клеток в ишемизированные мышцы позволяет сократить в два раза срок создания нового микроциркуляторного русла [3]. Однако, в условиях критической ишемии нижних конечностей этот срок является слишком длительным: конечность не удается спасти в большинстве случаев [4, 5].

Повысить эффективность терапевтического неоангиогенеза позволяет применение фармакологических препаратов, обладающих выраженным перфузионным эффектом, чем выше перфузия ишемизированных тканей, тем быстрее развивается новое микроциркуляторное русло [6]. В последние годы в клинической практике для лечения перемежающей хромоты, возникающий при хронической ишемии нижних конечностей на фоне облитерирующих заболеваний артерий, стал широко применяться новый лекарственный препарат «Цилостозол»,который является ингибитором фосфодиэстеразы (ФЭД)-3 и обладает выраженным вазодилятирующим эффектом. В организме человека существует 11 типов фосфодиэстеразы. Блокируя тот или иной тип лекарственным препаратом можно добиться нужного эффекта: вызвать бронходилятацию, вазодилятацию, устранить эректильную дисфункцию у мужчин, острую сердечную недостаточность и др. [7].

ФЭД-5 содержится в эндотелиальных клетках стенок сосудов, а ее ингибиторы (уденафил, синденафил)  обладают вазодилятирующим действием и применяются в клинической практике для устранения эректильной дисфункции у мужчин, путем увеличения притока крови в половой член  во время сексуального возбуждения [8]. Поэтому можно предположить, что ингибиторы ФЭД-5 как и ингибиторы ФЭД-3 должны оказывать положительное влияние на течение хронической ишемии конечности. Возрастание перфузии ишемизированных тканей, в свою очередь, может повысить эффективность клеточной терапии.

Цель. Изучить эффективность терапевтического ангиогенеза препаратом «Уденафил», мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга и их комбинацией при экспериментальной язвенно-некротической стадии критической ишемии нижних конечностей.

Материалы и методы

Эксперименты проводили на крысах линии Wistar в возрасте 4 месяцев, массой 220–250 г, прошедших карантин в условиях вивария НИИ экспериментальной медицины Курского государственного медицинского университета. Протокол исследования соответствовал этическим принципам и нормам проведения биомедицинских исследований с участием животных. Наркотизацию животных осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса, выведение из эксперимента - его передозировкой. Животных распределили по группам путем рандомизации со стратификацией по массе тела, а также по проводимым операциям и манипуляциям. Были сформированы следующие группы:  животные с ишемией конечности, не получавшие лечения (контрольная группа, n = 20);животные с ишемией мышц конечности, получавшие уденафил (первая опытная группа, n = 20); животные с ишемией конечности, получавшие мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга (вторая опытная группа,n = 20);животные с ишемией конечности, получавшие уденафил в комбинации с мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга (третья опытная группа, n = 20)

Оригинальный способ создания язвенно-некротической стадии ишемии конечностей в контрольной группе подробно описан нами ранее и заключался в иссечении  бедренной, подколенной и берцовых артерий и вен,пересечении периферического нерва[ 9].

В первой опытной группе после моделирования критической ишемии перорально вводили уденафил 8,6 мг/кг в течение 28 дней. Во второй опытной группе на фоне моделирования критической ишемии производили ее коррекцию мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.На7 сутки эксперимента после развития клинической картины язвенно-некротической стадии критической ишемии производили пункцию большеберцовой кости и аспирировали 1-2 мл клеток костного мозга..Мононуклеарную фракцию выделяли по методу Boyum [10] Однократно  введили  по 50 мкл мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга  в 2 точки:паравазально над  и под паховой связкой в места функционирующих ветвей подвздошной артерии,которые кровоснабжают мышцы верхней и средней трети бедра.  и в 2 точки  в ишемизированные мышцы нижней трети внутренней поверхности бедра и задней поверхности голени. .Введение аутоклеток костного мозга осуществляли по ходу функционирующих сосудов и в ишемизированные мышцы для создания новых путей притока артериальной крови.

В третьей опытной группе коррекция критической ишемии производилась комбинацией уденафила перорально в дозе 0,86 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 28дней и однократным  введением мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга, аналогично второй опытной группе животных.

Уровень микроциркуляции крови в мышцах голени определяли на 21 и 28-е сутки при помощи лазерной допплеровской флоуметрии, значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ).Предварительно перед началом эксперимента нами был определен у интактных животных нормальный уровень микроциркуляции в мышцах голени ,который оказался равным 531,86±12.08 ПЕ.

Животных выводили из эксперимента на 21 и 28-е сутки (по 10 крыс в каждый срок) путем передозировки наркоза. В каждом случае производили аутопсию с дальнейшей подготовкой препарата мышцы голени. Гистологический материал фиксировали в 10 % формалине в течение 7 сут. Парафиновые блоки и микропрепараты изготавливали по стандартной методике.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel 10.0. Рассчитывали средние значения (M) показателей и ошибки среднего (m). Использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями для сравнения показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при p <0,05.

 

Результаты и их обсуждение

 

Оценка уровня микроциркуляции в группа у экспериментальных животных представлена в таблице 1.

Таблица 1. Результаты оценки уровня микроциркуляции в мышцах голени у экспериментальных животных, (M±m) в перфузионных единицах

Table 1. Results of the assessment of the level of microcirculation in the muscles of the lower leg in experimental animals, (M±m) in perfusion unitsм

Группа животных/ Group of animals	21 сутки/21 days (n=10)	28 сутки/28 days(n=10)
Контрольная (моделирование критической ишемии)/ Control (modeling of critical ischemia)	249,1±7,31*	302,9±6,46*
1опытная(моделирование критической ишемии и ее коррекция уденафилом)/ 1 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil)	394,6±5,99*   **	486,7±7,59*   **
2опытная (моделирование критической ишемии и ее коррекция мононуклеарной фракцией костного мозга)/ 2 experimental (modeling of critical ischemia and its correction of the bone marrow mononuclear fraction)	401,3±10,87*   **	504,8±8,52*   **
3опытная (моделирование критической ишемии и ее коррекция уденафилом и мононуклеарной фракцией костного мозга)/ 3 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil and bone marrow mononuclear fraction) 3 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil and bone marrow mononuclear fraction)	451,9±19,8*  **  ***	543,4±11,25**   ***

Примечание: * - p<0,05 в сравнении с интактными животными; ** - p <0,05 в сравнении с контрольной группой; *** - p<0,05 в сравнении с первой  и второй опытными группами.

Note: * - p<0.05 in comparison with intact animals; * * - p <0.05 in comparison with the control group; *** - p<0.05 in comparison with the first and second experimental groups.

 

. В контрольной группе уровень регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс стал меньше чем в группе интактных животных на 21-е сутки в 2,1 раза и на 28-е сутки в 1,8 раза. В 1опытной группе после введения животным уденафила регионарный кровоток увеличивался на 21-е и на 28-е сутки в 1,6 раза, по сравнению с контрольной  группой животных. Во 2опытной группе при введении животным мононуклеарной фракции костного мозга кровоток увеличился соответственно в 1,6 раза и 1,7 раза. В 3опытной группе после комбинированного применения клеток костного мозга и уденафила регионарный кровоток возрастал на 21-е и на 28-е - 1,8 раза

На 28-е сутки в контрольной группе животных с критической ишемией в пораженных мышцах наблюдалась картина тяжелого воспалительного процесса.. Визуализировались общирные участки некротизированных тканей,которые были инфильтрированы нейтрофилами и лимфоцитами.В прилегающей к участкам некроза мышечной ткани определялись  атрофированные  волокна.. В  соединительнотканных прослойках гистологические признаки воспалительного процесса были менее выраженными.  Визуализировались как клетки воспалительного ряда (лимфоциты, моноциты, тучные , нейтрофилы и эозинофилы),так и клетки репаративного- единичные фибробласты и фиброциты. В окружности мышцы был выраженный интерстициальный отек, появлялись  новые единичные капилляры .. ( рисунок 1А).

   

А/A                             Б/B                             В/C                             Г/D

 

Рис. 1 Микрофотография среза скелетной мышечной ткани в области средней трети голени у крыс на 28-е сутки эксперимента. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х400. А – мышцы голени крыс контрольной группы; Б – ишемизированные мышцы голени крыс, получавших уденафил; В - ишемизированные мышцы голени крыс после введения мононуклеарной фракции костного мозга; Г - ишемизированные мышцы голени крыс, получавших уденафил в комбинации с мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.

Fig. 1 Micrograph of a section of skeletal muscle tissue in the middle third of the lower leg in rats on the 28th day of the experiment. Stained with hematoxylin and eosin. Uv. x400. A – lower leg muscles of rats of the control group; B – ischemic lower leg muscles of rats treated with udenafil; C - ischemic lower leg muscles of rats after administration of the mononuclear fraction of bone marrow; D - ischemic lower leg muscles of rats treated with udenafil in combination with the mononuclear fraction of autologous bone marrow.

При гистологическом исследовании мышечной ткани в первой опытной группе обнаружена положительная динамика. Во-первых, участки некроза начали ограничиваться и замещаться грануляционной тканью. Изменилось соотношение клеточного компонента в сторону преобладания клеток репаративного над клетками воспалительного ряда. Во-вторых, вблизи участков некроза появились многочисленные вновь образованные капилляры Однако в прослойках соединительной ткани между скелетными мышцами сохранялась клеточная инфильтрация, что свидетельствовало о незавершенности воспалительного процесса. (рисунок 1Б).

При микроскопии у животных во второй опытной группе после введения мононуклеарных клеток костного мозга, также, как и в первой опытной группе, выявлено снижение степени воспалительного процесса, что проявлялось уменьшением количества и размеров некротических участков, замещением их молодой соединительной тканью. Продолжала сохраняться круглоклеточная инфильтрация. В прослойках соединительной ткани  регистрироваться клеточные элементы воспалительного процесса. Артериолы и венулы, вокруг очагов некроза были расширены с признаками тромбоза. Как и у животных первой группы определялись многочисленные новообразованные капилляры. Однако. единого микроциркуляторного русла не образовалось (рисунок 1В).

Степень выраженности некротических изменений в группе, получавшей комбинированное лечение уденафилом и мононуклеарной фракцией костного мозга, была минимальной, среди всех групп наблюдения. Симпласты мышечных волокон имели однородную окраску саркоплазмы. При визуализации под большим увеличением, как на поперечных, так и на продольных срезах определялись мелкие вытянутой формы расположенные по периферии мышечных волокон ядра. В прослойках соединительной ткани плотность клеток была низкая, в поле зрения преобладали клетки фибробластического дифферона. Определялись единичные лимфоциты, мелкие тучные клетки, преимущественно в стадии накопления секрета. Артериолы и венулы, наполнены кровью, без признаков структурных нарушений. В широких прослойках соединительной ткани (в участках между мышц, где изначально локализовались крупные сосуды) визуализировалось большое количество новообразованных кровеносных сосудов с признаками тромбоза. Определялись вновь сформированные.артериолы и венулы.которые вместе с капиллярами создавали  единую сеть.. В стенке сосудов определялись плоские эндотелиоциты , ось клетки ориентирована вдоль базальной мембраны, мышечная оболочка образована гладкими миоцитами, без признаков фиброза. Можно считать что у животных этой группы сформировалось новое микроциркуляторное русло(рисунок1Г).

 

Проведенное исследование показало, что ингибитор фосфодиэстеразы-5уденофил улучшает перфузию ишемизированных тканей и тем самым предотвращает распространение некротического процесса. Уденафил так же способствует образованию новых капилляров, но эффективность его не достаточна ,чтобы  вызвать полноценный ангиогенез.

Изолированное введение аутологичных клеток костного мозга позволяет ограничить очаги некроза соединительной тканью и увеличить перфузию ишемизированных мышц. Однако, новое микроциркуляторное русло к концу эксперимента оказалось не сфоримированным. Лишь при комбинированном применении уденафила и мононуклеарной фракции костного мозга к концу эксперимента в ишемизированных тканях сформировалось новое микроциркуляторное русло.

 Основной причиной неудач клеточной терапии в стадии критической ишемии нижних конечностей является недостаточная перфузия ишемизированных тканей. Поэтому применение ингибиторов фосфодиэстеразы -5 , обладающих вазодилятирующим действием,в лечении сердечно-сосудистых заболеваний  является вполне оправданным [11]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 Комбинированное применение при экспериментальной ишемии конечности уденафила и мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга позволяет в 1,8 раза увеличить перфузию ишемизированных тканей и сформировать новое микроциркуляторное русло.

 

Дополнительная информация

 

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов.

Финансирование

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Курского государственного медицинского университета. Финансовой поддержки со стороны компаний производителей медицинского назначения авторы не получали.

Одобрение комитета по этике

Положительное заключение на экспериментальное исследование регионарного этического комитета Курского государственного медицинского университета(Протокол2 от 04.04.2019года.)

 

Об авторах

Борис Семенович Суковатых

Курский государственный медицинский университет

Email: SukovatykhBS@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-2197-8756
SPIN-код: 8778-1530

 д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей хирургии

Россия, Курск, Российская Федерация

Эльвин Эйнулла Фейзиев

Курский государственный медицинский университет

Email: elvin251546@gmail.com

соискатель кафедры общей хирургии

Россия, Курск, Российская Федерация

Мария Александровна Затолокина

Курский государственный медицинский университет

Email: zatolokinama@kursksmu.net

д.м.н., профессор кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, Курский государственный медицинский университет

Курск, Российская Федерация

Александр Сергеевич Белоус

Курский государственный медицинский университет

Email: a.s.belous@mail.ru

к.м.н., старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории «Генетика»

Россия, Курск, Российская Федерация

Михаил Борисович Суковатых

Курский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: SukovatykhMB@kursksmu.net

к.м.н., доцент кафедры общей хирургии Курского государственного медицинского университета

Россия, ул. К.Маркса, д3, Курск, 305041, Российская Федерация

Список литературы

Дополнительные файлы