Email this article 
Therapeutic Angiogenesis in the Experimental Ulcerative-Necrotic Stage of Critical Lower Limb Ischemia
- Authors: Sukovatykh B.S.1, Feyziev E.E.1, Zatolokina M.A.2, Belous A.S.2, Sukovatykh M.B.2
-
Affiliations:
- Kursk state medical University
- Kursk State Medical University
- Issue: Vol 15, No 1 (2022)
- Pages: 58-63
- Section: Original articles
- URL: https://vestnik-surgery.com/journal/article/view/1539
- DOI: https://doi.org/10.18499/2070-478X-2022-15-1-58-63
- ID: 1539
Cite item
Full Text
Abstract
Introduction. The effectiveness of therapeutic angiogenesis in the ulcerative-necrotic stage is insufficient to preserve the limb.
The aim of research was to study the effectiveness of therapeutic angiogenesis with "Udenafil", mononuclear fraction of autologous bone marrow and their combination in the experimental ulcerative-necrotic stage of critical lower limb ischemia.
Materials and methods. Lower leg muscle ischemia was simulated on Wistar rats. All animals were divided into 4 groups, 20 animals in each group: with simulated critical ischemia without treatment (control group); with critical ischemia and monotherapy with udenafil (udenafil, orally, 8.6 mg/kg for 28 days, the first experimental group); with critical ischemia and monotherapy with mononuclear fraction of autologous bone marrow (a single paravasal injection of a mononuclear fraction of autologous bone marrow in 7 days after critical ischemia simulation, the second experimental group); with critical ischemia and combined therapy (udenafil orally, 0.86 mg/kg, once a day, for 28 days, and a single paravasal injection with a mononuclear fraction of autologous bone marrow, similar to the group with monotherapy, the third experimental group). The level of blood microcirculation in the lower leg muscles was measured in 21 and 28 days; after that, histological examination was performed.
Results. In the control group, the regional blood flow rate in the ischemic shin muscle was 2.1 times less than in intact animals in 21 days and 1.8 times less in 28 days after simulated critical ischemia. In the first experimental group, the regional blood flow rate increased by 1.6 times in 21 days and 28 days after udenafil administration; in the second experimental group, the regional blood flow rate increased by 1.6 times and 1.7 times, respectively, after the mononuclear fraction of bone marrow was administered to animals; and in the third experimental group, the regional blood flow rate increased 1.8 times, compared with the animals of the control group after the combined use of bone marrow cells and udenafil. In 28 days after the start of the experiment, histological tests detected foci of necrosis with perifocal inflammation in the ischemic muscles of the lower leg in animals of the control group. In the first and second experimental groups, a decreased size and number of necrosis sites was registered due to formation of young connective tissue and new capillaries. None of newly formed microcirculatory bed was detected. In the third experimental group, the severity of necrotic changes was minimal, a large number of newly formed blood vessels (arterioles) were visualized in wide layers of the connective tissue (capillaries, venules); this was a new microcirculatory bed.
Conclusion. Application of udenafil combined with the mononuclear fraction of the bone marrow results in an increased perfusion of ischemic tissues and development of a new microcirculatory bed.
Full Text
Введение. Реакцией организма на ишемию тканей является создание нового микроциркуляторного русла, которое описывается в литературе как неоангиогенез. Чем быстрее образуется новая сеть, тем меньше будет площадь некроза, тем быстрее восстановится функция органа [1]. Неоангиогенез развивается постепенно. В течение первого месяца появляются единичные новые капилляры, а для развития микроциркуляторного русла, включающего артериолы, капилляры, венулы и артериовенозные шунты требуется шесть-двенадцать месяцев [2]. Целью терапевтического ангиогенеза является ускорение образования новой сосудистой сети. Проведенные раннее исследования показали, что наибольшей эффективностью обладают мононуклеарные клетки аутологичного костного мозга. Введение этих клеток в ишемизированные мышцы позволяет сократить в два раза срок создания нового микроциркуляторного русла [3]. Однако, в условиях критической ишемии нижних конечностей этот срок является слишком длительным: конечность не удается спасти в большинстве случаев [4, 5].
Повысить эффективность терапевтического неоангиогенеза позволяет применение фармакологических препаратов, обладающих выраженным перфузионным эффектом, чем выше перфузия ишемизированных тканей, тем быстрее развивается новое микроциркуляторное русло [6]. В последние годы в клинической практике для лечения перемежающей хромоты, возникающий при хронической ишемии нижних конечностей на фоне облитерирующих заболеваний артерий, стал широко применяться новый лекарственный препарат «Цилостозол»,который является ингибитором фосфодиэстеразы (ФЭД)-3 и обладает выраженным вазодилятирующим эффектом. В организме человека существует 11 типов фосфодиэстеразы. Блокируя тот или иной тип лекарственным препаратом можно добиться нужного эффекта: вызвать бронходилятацию, вазодилятацию, устранить эректильную дисфункцию у мужчин, острую сердечную недостаточность и др. [7].
ФЭД-5 содержится в эндотелиальных клетках стенок сосудов, а ее ингибиторы (уденафил, синденафил) обладают вазодилятирующим действием и применяются в клинической практике для устранения эректильной дисфункции у мужчин, путем увеличения притока крови в половой член во время сексуального возбуждения [8]. Поэтому можно предположить, что ингибиторы ФЭД-5 как и ингибиторы ФЭД-3 должны оказывать положительное влияние на течение хронической ишемии конечности. Возрастание перфузии ишемизированных тканей, в свою очередь, может повысить эффективность клеточной терапии.
Цель. Изучить эффективность терапевтического ангиогенеза препаратом «Уденафил», мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга и их комбинацией при экспериментальной язвенно-некротической стадии критической ишемии нижних конечностей.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на крысах линии Wistar в возрасте 4 месяцев, массой 220–250 г, прошедших карантин в условиях вивария НИИ экспериментальной медицины Курского государственного медицинского университета. Протокол исследования соответствовал этическим принципам и нормам проведения биомедицинских исследований с участием животных. Наркотизацию животных осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса, выведение из эксперимента - его передозировкой. Животных распределили по группам путем рандомизации со стратификацией по массе тела, а также по проводимым операциям и манипуляциям. Были сформированы следующие группы: животные с ишемией конечности, не получавшие лечения (контрольная группа, n = 20);животные с ишемией мышц конечности, получавшие уденафил (первая опытная группа, n = 20); животные с ишемией конечности, получавшие мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга (вторая опытная группа,n = 20);животные с ишемией конечности, получавшие уденафил в комбинации с мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга (третья опытная группа, n = 20)
Оригинальный способ создания язвенно-некротической стадии ишемии конечностей в контрольной группе подробно описан нами ранее и заключался в иссечении бедренной, подколенной и берцовых артерий и вен,пересечении периферического нерва[ 9].
В первой опытной группе после моделирования критической ишемии перорально вводили уденафил 8,6 мг/кг в течение 28 дней. Во второй опытной группе на фоне моделирования критической ишемии производили ее коррекцию мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.На7 сутки эксперимента после развития клинической картины язвенно-некротической стадии критической ишемии производили пункцию большеберцовой кости и аспирировали 1-2 мл клеток костного мозга..Мононуклеарную фракцию выделяли по методу Boyum [10] Однократно введили по 50 мкл мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга в 2 точки:паравазально над и под паховой связкой в места функционирующих ветвей подвздошной артерии,которые кровоснабжают мышцы верхней и средней трети бедра. и в 2 точки в ишемизированные мышцы нижней трети внутренней поверхности бедра и задней поверхности голени. .Введение аутоклеток костного мозга осуществляли по ходу функционирующих сосудов и в ишемизированные мышцы для создания новых путей притока артериальной крови.
В третьей опытной группе коррекция критической ишемии производилась комбинацией уденафила перорально в дозе 0,86 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 28дней и однократным введением мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга, аналогично второй опытной группе животных.
Уровень микроциркуляции крови в мышцах голени определяли на 21 и 28-е сутки при помощи лазерной допплеровской флоуметрии, значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ).Предварительно перед началом эксперимента нами был определен у интактных животных нормальный уровень микроциркуляции в мышцах голени ,который оказался равным 531,86±12.08 ПЕ.
Животных выводили из эксперимента на 21 и 28-е сутки (по 10 крыс в каждый срок) путем передозировки наркоза. В каждом случае производили аутопсию с дальнейшей подготовкой препарата мышцы голени. Гистологический материал фиксировали в 10 % формалине в течение 7 сут. Парафиновые блоки и микропрепараты изготавливали по стандартной методике.
Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel 10.0. Рассчитывали средние значения (M) показателей и ошибки среднего (m). Использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями для сравнения показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при p <0,05.
Результаты и их обсуждение
Оценка уровня микроциркуляции в группа у экспериментальных животных представлена в таблице 1.
Таблица 1. Результаты оценки уровня микроциркуляции в мышцах голени у экспериментальных животных, (M±m) в перфузионных единицах
Table 1. Results of the assessment of the level of microcirculation in the muscles of the lower leg in experimental animals, (M±m) in perfusion unitsм
Группа животных/ Group of animals | 21 сутки/21 days (n=10) | 28 сутки/28 days(n=10) |
Контрольная (моделирование критической ишемии)/ Control (modeling of critical ischemia) | 249,1±7,31* | 302,9±6,46* |
1опытная(моделирование критической ишемии и ее коррекция уденафилом)/ 1 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil) | 394,6±5,99* ** | 486,7±7,59* ** |
2опытная (моделирование критической ишемии и ее коррекция мононуклеарной фракцией костного мозга)/ 2 experimental (modeling of critical ischemia and its correction of the bone marrow mononuclear fraction) | 401,3±10,87* ** | 504,8±8,52* ** |
3опытная (моделирование критической ишемии и ее коррекция уденафилом и мононуклеарной фракцией костного мозга)/ 3 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil and bone marrow mononuclear fraction) 3 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil and bone marrow mononuclear fraction) | 451,9±19,8* ** *** | 543,4±11,25** *** |
Примечание: * - p<0,05 в сравнении с интактными животными; ** - p <0,05 в сравнении с контрольной группой; *** - p<0,05 в сравнении с первой и второй опытными группами.
Note: * - p<0.05 in comparison with intact animals; * * - p <0.05 in comparison with the control group; *** - p<0.05 in comparison with the first and second experimental groups.
. В контрольной группе уровень регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс стал меньше чем в группе интактных животных на 21-е сутки в 2,1 раза и на 28-е сутки в 1,8 раза. В 1опытной группе после введения животным уденафила регионарный кровоток увеличивался на 21-е и на 28-е сутки в 1,6 раза, по сравнению с контрольной группой животных. Во 2опытной группе при введении животным мононуклеарной фракции костного мозга кровоток увеличился соответственно в 1,6 раза и 1,7 раза. В 3опытной группе после комбинированного применения клеток костного мозга и уденафила регионарный кровоток возрастал на 21-е и на 28-е - 1,8 раза
На 28-е сутки в контрольной группе животных с критической ишемией в пораженных мышцах наблюдалась картина тяжелого воспалительного процесса.. Визуализировались общирные участки некротизированных тканей,которые были инфильтрированы нейтрофилами и лимфоцитами.В прилегающей к участкам некроза мышечной ткани определялись атрофированные волокна.. В соединительнотканных прослойках гистологические признаки воспалительного процесса были менее выраженными. Визуализировались как клетки воспалительного ряда (лимфоциты, моноциты, тучные , нейтрофилы и эозинофилы),так и клетки репаративного- единичные фибробласты и фиброциты. В окружности мышцы был выраженный интерстициальный отек, появлялись новые единичные капилляры .. ( рисунок 1А).
А/A Б/B В/C Г/D
Рис. 1 Микрофотография среза скелетной мышечной ткани в области средней трети голени у крыс на 28-е сутки эксперимента. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х400. А – мышцы голени крыс контрольной группы; Б – ишемизированные мышцы голени крыс, получавших уденафил; В - ишемизированные мышцы голени крыс после введения мононуклеарной фракции костного мозга; Г - ишемизированные мышцы голени крыс, получавших уденафил в комбинации с мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.
Fig. 1 Micrograph of a section of skeletal muscle tissue in the middle third of the lower leg in rats on the 28th day of the experiment. Stained with hematoxylin and eosin. Uv. x400. A – lower leg muscles of rats of the control group; B – ischemic lower leg muscles of rats treated with udenafil; C - ischemic lower leg muscles of rats after administration of the mononuclear fraction of bone marrow; D - ischemic lower leg muscles of rats treated with udenafil in combination with the mononuclear fraction of autologous bone marrow.
При гистологическом исследовании мышечной ткани в первой опытной группе обнаружена положительная динамика. Во-первых, участки некроза начали ограничиваться и замещаться грануляционной тканью. Изменилось соотношение клеточного компонента в сторону преобладания клеток репаративного над клетками воспалительного ряда. Во-вторых, вблизи участков некроза появились многочисленные вновь образованные капилляры Однако в прослойках соединительной ткани между скелетными мышцами сохранялась клеточная инфильтрация, что свидетельствовало о незавершенности воспалительного процесса. (рисунок 1Б).
При микроскопии у животных во второй опытной группе после введения мононуклеарных клеток костного мозга, также, как и в первой опытной группе, выявлено снижение степени воспалительного процесса, что проявлялось уменьшением количества и размеров некротических участков, замещением их молодой соединительной тканью. Продолжала сохраняться круглоклеточная инфильтрация. В прослойках соединительной ткани регистрироваться клеточные элементы воспалительного процесса. Артериолы и венулы, вокруг очагов некроза были расширены с признаками тромбоза. Как и у животных первой группы определялись многочисленные новообразованные капилляры. Однако. единого микроциркуляторного русла не образовалось (рисунок 1В).
Степень выраженности некротических изменений в группе, получавшей комбинированное лечение уденафилом и мононуклеарной фракцией костного мозга, была минимальной, среди всех групп наблюдения. Симпласты мышечных волокон имели однородную окраску саркоплазмы. При визуализации под большим увеличением, как на поперечных, так и на продольных срезах определялись мелкие вытянутой формы расположенные по периферии мышечных волокон ядра. В прослойках соединительной ткани плотность клеток была низкая, в поле зрения преобладали клетки фибробластического дифферона. Определялись единичные лимфоциты, мелкие тучные клетки, преимущественно в стадии накопления секрета. Артериолы и венулы, наполнены кровью, без признаков структурных нарушений. В широких прослойках соединительной ткани (в участках между мышц, где изначально локализовались крупные сосуды) визуализировалось большое количество новообразованных кровеносных сосудов с признаками тромбоза. Определялись вновь сформированные.артериолы и венулы.которые вместе с капиллярами создавали единую сеть.. В стенке сосудов определялись плоские эндотелиоциты , ось клетки ориентирована вдоль базальной мембраны, мышечная оболочка образована гладкими миоцитами, без признаков фиброза. Можно считать что у животных этой группы сформировалось новое микроциркуляторное русло(рисунок1Г).
Проведенное исследование показало, что ингибитор фосфодиэстеразы-5уденофил улучшает перфузию ишемизированных тканей и тем самым предотвращает распространение некротического процесса. Уденафил так же способствует образованию новых капилляров, но эффективность его не достаточна ,чтобы вызвать полноценный ангиогенез.
Изолированное введение аутологичных клеток костного мозга позволяет ограничить очаги некроза соединительной тканью и увеличить перфузию ишемизированных мышц. Однако, новое микроциркуляторное русло к концу эксперимента оказалось не сфоримированным. Лишь при комбинированном применении уденафила и мононуклеарной фракции костного мозга к концу эксперимента в ишемизированных тканях сформировалось новое микроциркуляторное русло.
Основной причиной неудач клеточной терапии в стадии критической ишемии нижних конечностей является недостаточная перфузия ишемизированных тканей. Поэтому применение ингибиторов фосфодиэстеразы -5 , обладающих вазодилятирующим действием,в лечении сердечно-сосудистых заболеваний является вполне оправданным [11]
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Комбинированное применение при экспериментальной ишемии конечности уденафила и мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга позволяет в 1,8 раза увеличить перфузию ишемизированных тканей и сформировать новое микроциркуляторное русло.
Дополнительная информация
Конфликт интересов
Авто
Введение. Реакцией организма на ишемию тканей является создание нового микроциркуляторного русла, которое описывается в литературе как неоангиогенез. Чем быстрее образуется новая сеть, тем меньше будет площадь некроза, тем быстрее восстановится функция органа [1]. Неоангиогенез развивается постепенно. В течение первого месяца появляются единичные новые капилляры, а для развития микроциркуляторного русла, включающего артериолы, капилляры, венулы и артериовенозные шунты требуется шесть-двенадцать месяцев [2]. Целью терапевтического ангиогенеза является ускорение образования новой сосудистой сети. Проведенные раннее исследования показали, что наибольшей эффективностью обладают мононуклеарные клетки аутологичного костного мозга. Введение этих клеток в ишемизированные мышцы позволяет сократить в два раза срок создания нового микроциркуляторного русла [3]. Однако, в условиях критической ишемии нижних конечностей этот срок является слишком длительным: конечность не удается спасти в большинстве случаев [4, 5].
Повысить эффективность терапевтического неоангиогенеза позволяет применение фармакологических препаратов, обладающих выраженным перфузионным эффектом, чем выше перфузия ишемизированных тканей, тем быстрее развивается новое микроциркуляторное русло [6]. В последние годы в клинической практике для лечения перемежающей хромоты, возникающий при хронической ишемии нижних конечностей на фоне облитерирующих заболеваний артерий, стал широко применяться новый лекарственный препарат «Цилостозол»,который является ингибитором фосфодиэстеразы (ФЭД)-3 и обладает выраженным вазодилятирующим эффектом. В организме человека существует 11 типов фосфодиэстеразы. Блокируя тот или иной тип лекарственным препаратом можно добиться нужного эффекта: вызвать бронходилятацию, вазодилятацию, устранить эректильную дисфункцию у мужчин, острую сердечную недостаточность и др. [7].
ФЭД-5 содержится в эндотелиальных клетках стенок сосудов, а ее ингибиторы (уденафил, синденафил) обладают вазодилятирующим действием и применяются в клинической практике для устранения эректильной дисфункции у мужчин, путем увеличения притока крови в половой член во время сексуального возбуждения [8]. Поэтому можно предположить, что ингибиторы ФЭД-5 как и ингибиторы ФЭД-3 должны оказывать положительное влияние на течение хронической ишемии конечности. Возрастание перфузии ишемизированных тканей, в свою очередь, может повысить эффективность клеточной терапии.
Цель. Изучить эффективность терапевтического ангиогенеза препаратом «Уденафил», мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга и их комбинацией при экспериментальной язвенно-некротической стадии критической ишемии нижних конечностей.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на крысах линии Wistar в возрасте 4 месяцев, массой 220–250 г, прошедших карантин в условиях вивария НИИ экспериментальной медицины Курского государственного медицинского университета. Протокол исследования соответствовал этическим принципам и нормам проведения биомедицинских исследований с участием животных. Наркотизацию животных осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса, выведение из эксперимента - его передозировкой. Животных распределили по группам путем рандомизации со стратификацией по массе тела, а также по проводимым операциям и манипуляциям. Были сформированы следующие группы: животные с ишемией конечности, не получавшие лечения (контрольная группа, n = 20);животные с ишемией мышц конечности, получавшие уденафил (первая опытная группа, n = 20); животные с ишемией конечности, получавшие мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга (вторая опытная группа,n = 20);животные с ишемией конечности, получавшие уденафил в комбинации с мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга (третья опытная группа, n = 20)
Оригинальный способ создания язвенно-некротической стадии ишемии конечностей в контрольной группе подробно описан нами ранее и заключался в иссечении бедренной, подколенной и берцовых артерий и вен,пересечении периферического нерва[ 9].
В первой опытной группе после моделирования критической ишемии перорально вводили уденафил 8,6 мг/кг в течение 28 дней. Во второй опытной группе на фоне моделирования критической ишемии производили ее коррекцию мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.На7 сутки эксперимента после развития клинической картины язвенно-некротической стадии критической ишемии производили пункцию большеберцовой кости и аспирировали 1-2 мл клеток костного мозга..Мононуклеарную фракцию выделяли по методу Boyum [10] Однократно введили по 50 мкл мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга в 2 точки:паравазально над и под паховой связкой в места функционирующих ветвей подвздошной артерии,которые кровоснабжают мышцы верхней и средней трети бедра. и в 2 точки в ишемизированные мышцы нижней трети внутренней поверхности бедра и задней поверхности голени. .Введение аутоклеток костного мозга осуществляли по ходу функционирующих сосудов и в ишемизированные мышцы для создания новых путей притока артериальной крови.
В третьей опытной группе коррекция критической ишемии производилась комбинацией уденафила перорально в дозе 0,86 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно в течение 28дней и однократным введением мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга, аналогично второй опытной группе животных.
Уровень микроциркуляции крови в мышцах голени определяли на 21 и 28-е сутки при помощи лазерной допплеровской флоуметрии, значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ).Предварительно перед началом эксперимента нами был определен у интактных животных нормальный уровень микроциркуляции в мышцах голени ,который оказался равным 531,86±12.08 ПЕ.
Животных выводили из эксперимента на 21 и 28-е сутки (по 10 крыс в каждый срок) путем передозировки наркоза. В каждом случае производили аутопсию с дальнейшей подготовкой препарата мышцы голени. Гистологический материал фиксировали в 10 % формалине в течение 7 сут. Парафиновые блоки и микропрепараты изготавливали по стандартной методике.
Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel 10.0. Рассчитывали средние значения (M) показателей и ошибки среднего (m). Использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями для сравнения показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при p <0,05.
Результаты и их обсуждение
Оценка уровня микроциркуляции в группа у экспериментальных животных представлена в таблице 1.
Таблица 1. Результаты оценки уровня микроциркуляции в мышцах голени у экспериментальных животных, (M±m) в перфузионных единицах
Table 1. Results of the assessment of the level of microcirculation in the muscles of the lower leg in experimental animals, (M±m) in perfusion unitsм
Группа животных/ Group of animals | 21 сутки/21 days (n=10) | 28 сутки/28 days(n=10) |
Контрольная (моделирование критической ишемии)/ Control (modeling of critical ischemia) | 249,1±7,31* | 302,9±6,46* |
1опытная(моделирование критической ишемии и ее коррекция уденафилом)/ 1 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil) | 394,6±5,99* ** | 486,7±7,59* ** |
2опытная (моделирование критической ишемии и ее коррекция мононуклеарной фракцией костного мозга)/ 2 experimental (modeling of critical ischemia and its correction of the bone marrow mononuclear fraction) | 401,3±10,87* ** | 504,8±8,52* ** |
3опытная (моделирование критической ишемии и ее коррекция уденафилом и мононуклеарной фракцией костного мозга)/ 3 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil and bone marrow mononuclear fraction) 3 experimental (modeling of critical ischemia and its correction with udenafil and bone marrow mononuclear fraction) | 451,9±19,8* ** *** | 543,4±11,25** *** |
Примечание: * - p<0,05 в сравнении с интактными животными; ** - p <0,05 в сравнении с контрольной группой; *** - p<0,05 в сравнении с первой и второй опытными группами.
Note: * - p<0.05 in comparison with intact animals; * * - p <0.05 in comparison with the control group; *** - p<0.05 in comparison with the first and second experimental groups.
. В контрольной группе уровень регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс стал меньше чем в группе интактных животных на 21-е сутки в 2,1 раза и на 28-е сутки в 1,8 раза. В 1опытной группе после введения животным уденафила регионарный кровоток увеличивался на 21-е и на 28-е сутки в 1,6 раза, по сравнению с контрольной группой животных. Во 2опытной группе при введении животным мононуклеарной фракции костного мозга кровоток увеличился соответственно в 1,6 раза и 1,7 раза. В 3опытной группе после комбинированного применения клеток костного мозга и уденафила регионарный кровоток возрастал на 21-е и на 28-е - 1,8 раза
На 28-е сутки в контрольной группе животных с критической ишемией в пораженных мышцах наблюдалась картина тяжелого воспалительного процесса.. Визуализировались общирные участки некротизированных тканей,которые были инфильтрированы нейтрофилами и лимфоцитами.В прилегающей к участкам некроза мышечной ткани определялись атрофированные волокна.. В соединительнотканных прослойках гистологические признаки воспалительного процесса были менее выраженными. Визуализировались как клетки воспалительного ряда (лимфоциты, моноциты, тучные , нейтрофилы и эозинофилы),так и клетки репаративного- единичные фибробласты и фиброциты. В окружности мышцы был выраженный интерстициальный отек, появлялись новые единичные капилляры .. ( рисунок 1А).
А/A Б/B В/C Г/D
Рис. 1 Микрофотография среза скелетной мышечной ткани в области средней трети голени у крыс на 28-е сутки эксперимента. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х400. А – мышцы голени крыс контрольной группы; Б – ишемизированные мышцы голени крыс, получавших уденафил; В - ишемизированные мышцы голени крыс после введения мононуклеарной фракции костного мозга; Г - ишемизированные мышцы голени крыс, получавших уденафил в комбинации с мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.
Fig. 1 Micrograph of a section of skeletal muscle tissue in the middle third of the lower leg in rats on the 28th day of the experiment. Stained with hematoxylin and eosin. Uv. x400. A – lower leg muscles of rats of the control group; B – ischemic lower leg muscles of rats treated with udenafil; C - ischemic lower leg muscles of rats after administration of the mononuclear fraction of bone marrow; D - ischemic lower leg muscles of rats treated with udenafil in combination with the mononuclear fraction of autologous bone marrow.
При гистологическом исследовании мышечной ткани в первой опытной группе обнаружена положительная динамика. Во-первых, участки некроза начали ограничиваться и замещаться грануляционной тканью. Изменилось соотношение клеточного компонента в сторону преобладания клеток репаративного над клетками воспалительного ряда. Во-вторых, вблизи участков некроза появились многочисленные вновь образованные капилляры Однако в прослойках соединительной ткани между скелетными мышцами сохранялась клеточная инфильтрация, что свидетельствовало о незавершенности воспалительного процесса. (рисунок 1Б).
При микроскопии у животных во второй опытной группе после введения мононуклеарных клеток костного мозга, также, как и в первой опытной группе, выявлено снижение степени воспалительного процесса, что проявлялось уменьшением количества и размеров некротических участков, замещением их молодой соединительной тканью. Продолжала сохраняться круглоклеточная инфильтрация. В прослойках соединительной ткани регистрироваться клеточные элементы воспалительного процесса. Артериолы и венулы, вокруг очагов некроза были расширены с признаками тромбоза. Как и у животных первой группы определялись многочисленные новообразованные капилляры. Однако. единого микроциркуляторного русла не образовалось (рисунок 1В).
Степень выраженности некротических изменений в группе, получавшей комбинированное лечение уденафилом и мононуклеарной фракцией костного мозга, была минимальной, среди всех групп наблюдения. Симпласты мышечных волокон имели однородную окраску саркоплазмы. При визуализации под большим увеличением, как на поперечных, так и на продольных срезах определялись мелкие вытянутой формы расположенные по периферии мышечных волокон ядра. В прослойках соединительной ткани плотность клеток была низкая, в поле зрения преобладали клетки фибробластического дифферона. Определялись единичные лимфоциты, мелкие тучные клетки, преимущественно в стадии накопления секрета. Артериолы и венулы, наполнены кровью, без признаков структурных нарушений. В широких прослойках соединительной ткани (в участках между мышц, где изначально локализовались крупные сосуды) визуализировалось большое количество новообразованных кровеносных сосудов с признаками тромбоза. Определялись вновь сформированные.артериолы и венулы.которые вместе с капиллярами создавали единую сеть.. В стенке сосудов определялись плоские эндотелиоциты , ось клетки ориентирована вдоль базальной мембраны, мышечная оболочка образована гладкими миоцитами, без признаков фиброза. Можно считать что у животных этой группы сформировалось новое микроциркуляторное русло(рисунок1Г).
Проведенное исследование показало, что ингибитор фосфодиэстеразы-5уденофил улучшает перфузию ишемизированных тканей и тем самым предотвращает распространение некротического процесса. Уденафил так же способствует образованию новых капилляров, но эффективность его не достаточна ,чтобы вызвать полноценный ангиогенез.
Изолированное введение аутологичных клеток костного мозга позволяет ограничить очаги некроза соединительной тканью и увеличить перфузию ишемизированных мышц. Однако, новое микроциркуляторное русло к концу эксперимента оказалось не сфоримированным. Лишь при комбинированном применении уденафила и мононуклеарной фракции костного мозга к концу эксперимента в ишемизированных тканях сформировалось новое микроциркуляторное русло.
Основной причиной неудач клеточной терапии в стадии критической ишемии нижних конечностей является недостаточная перфузия ишемизированных тканей. Поэтому применение ингибиторов фосфодиэстеразы -5 , обладающих вазодилятирующим действием,в лечении сердечно-сосудистых заболеваний является вполне оправданным [11]
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Комбинированное применение при экспериментальной ишемии конечности уденафила и мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга позволяет в 1,8 раза увеличить перфузию ишемизированных тканей и сформировать новое микроциркуляторное русло.
Дополнительная информация
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов.
Финансирование
Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Курского государственного медицинского университета. Финансовой поддержки со стороны компаний производителей медицинского назначения авторы не получали.
Одобрение комитета по этике
Положительное заключение на экспериментальное исследование регионарного этического комитета Курского государственного медицинского университета(Протокол2 от 04.04.2019года.)
About the authors
Boris Semenovich Sukovatykh
Kursk state medical University
Email: SukovatykhBS@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-2197-8756
SPIN-code: 8778-1530
M.D., Professor, Head Department of General Surgery
Russian Federation, Kursk, Russian FederationElvin Eynulla Feyziev
Kursk state medical University
Email: elvin251546@gmail.com
applicant for the Department of General Surgery
Russian Federation, Kursk, Russian FederationMaria Alexandrovna Zatolokina
Kursk State Medical University
Email: zatolokinama@kursksmu.net
M.D., Professor of the department of Histology, Cytology, Embryology,
Kursk, Russian FederationAlexander Sergeevich Belous
Kursk State Medical University
Email: a.s.belous@mail.ru
Ph.D., Senior Researcher, Research Laboratory "Genetics"
Russian Federation, Kursk, Russian FederationMikhail Borisovich Sukovatykh
Kursk State Medical University
Author for correspondence.
Email: SukovatykhMB@kursksmu.net
Ph.D., Associate Professor of the Department of General Surgery, Kursk State Medical University
Russian Federation, st. K. Marksa, d3, Kursk, 305041, Russian FederationReferences
- Asahara T., Kawamoto A., Masuda H. Concise review: circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem. Cells. 2011; 29: 11: 1650-1655, doi: 10.1002/stem.745.
- Fujita Y., Kawamoto A. Stem cell-based peripheral vascular regeneration. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2017; 120: 25-40. doi: 10.1016/j.addr.2017.09.001.
- Osipova O. S., Saaya Sh. B., Karpenko A. A., Zakiyan S. M. Problems and prospects of cell therapy of critical lower limb ischemia. Angiology and vascular surgery.2020; 26(2):23-33( In Russ.).
- Peeters Weem S.M., Teraa M., De Borst G.J., et al. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2015; 50: 6: 775-783. doi: 10.1016/j.ejvs.2015.08.018.
- Rigato M., Monami M., Fadini G.P. Autologous cell therapy for peripheral arterial disease: systematic review and meta-analysis of randomized non-randomized, and non-controlled studies. Circ. Res. 2017; 120: 8: 1326-1340. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.309045.
- Murphy M.P., Ross C.B., Kibbe M. Intramuscular injection of autologous bone marrow cells to prevent amputation in critical limb ischemia: the results of the phase IIIMOBILE Trial. J. Vasc. Surg. 2017; 65: 131-132.
- Arkhipov V.V. Clinical pharmacology of phosphoesterase inhibitors. Klinicheskaya farmakologiya. 2014; 3: 35-41( In Russ.).
- Gamidov S.I., Ovchinnikov R.I., Popova A.Yu., Izhbaev S.Kh. Phosphodiesterase type 5 inhibitors in the treatment of erectile dysfunction: past, present and future. Urologiya. 2017; 1: 103-108. ( In Russ.).
- Feiziev EE, Belous AS, Sukovatykh BS, Trubnikova EV. Patent No 2734158 Rossiiskaya Federatsiya. Sposob modelirovaniya kriticheskoi ishemii nizhnikh konechnostei u eksperimental'nykh zhivotnykh - krys No 2020111315. Kurskii gosudarstvennyi universitet zayavl 18.03.2020 ( In Russ.).
- Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Investig.1998;21(97):1–9.
- Tzoumas N, Farrah TE, Dhaun N, Webb DJ. Established and emerging therapeutic uses of PDE type 5 inhibitors in cardiovascular disease. British Journal of Pharmacology. 2020;177(24):5467-5488. doi: 10. 1111/bph.14920.
Supplementary files
