Clinical and experimental substantiation of the effect of hypoxia on the wall of the small and large intestine in newborns

Abstract


Based on the analysis of morphological and morphometric data, the clinical and experimental results of the effect of hypoxia on the wall of the small and large intestine in newborns are presented. The clinical part is based on the study of 58 case histories of patients with necrotizing enterocolitis, which the operating material (resected sections of the small intestine, large intestine) was studied in detail. The experimental work included the modeling of chronic hypobaric hypoxia in different trimesters of pregnancy in 4 groups of white rats (24 females). The offspring was taken out of the experiment at 4-5 days after birth, followed by collection of the small and large intestine areas to study histoarchitectonics. It is proved that hypoxia affects the number of newborn offspring, its weight. The small intestine is most vulnerable to the effect of this factor. Analysis of the morphological and morphometric picture of the operating and experimental material convincingly proves that under the influence of hypoxia the destruction of the intestinal mucosa occurs and the growth of the connective tissue component in the muscle layer occurs.

Changes from the microcirculation of blood and lymph provoke the development of pre-ulcerative, ulcerative defects and the formation of necrosis. Disturbance of the drainage function promotes the spread of destruction in the intestinal wall.


Известно, что в основе патогенеза большинства врожденных и приобретенных заболеваний лежит гипоксия. Этот фактор обладает возможностью системно влиять на организм, приводя к остро возникающим или отсроченным патологическим процессам [1].
Некротизирующий энтероколит у новорожденных (НЭК) – это тяжелое заболевание, проявляющееся поражением кишечной стенки на фоне хронической внутриутробной или острой гипоксии ребенка в родах.
В основе патогенеза развития НЭК лежат сосудистые расстройства, приводящие к некрозу стенки желудочно-кишечного тракта разной степени глубины и протяженности. Перенесенные гипоксия и асфиксия ведут к централизации кровообращения, спазму мезентериальных сосудов вплоть до возникновения кровоизлияний [2, 3].
Наряду с клиническими исследованиями существует большое количество экспериментальных работ на животных, которые с позиции доказательной медицины подтверждают тяжесть воздействия гипоксии на организм, как в антенатальном, так и в постнатальном периодах [4, 5, 6, 7].
В отечественной и зарубежной литературе достаточно освещено воздействие гипоксии на головной мозг, почки, репродуктивные органы, однако практически отсутствуют фундаментальные работы, в которых отражены постгипоксические изменения в гистоархитектонике кишечной стенки.
Цель исследования: представить клинические и экспериментальные данные доказывающие влияния гипоксии на стенку тонкой и толстой кишки у новорожденных.

Материалы и методы
Дизайн исследования
Исследование основано на анализе 58 историй болезни пациентов с хирургическими стадиями некротизирующего энтероколита, лечившихся в 2012 – 2017гг. в клиниках детской хирургии Приволжского исследовательского медицинского университета на базе ГБУЗ НО «Детская городская клиническая больница № 1» и ГБУЗ НО «Нижегородская областная детская клиническая больница».
Критериями включения в исследование стали новорожденные дети с НЭК, в анамнезе которых отмечали хроническую внутриутробную гипоксию плода или острую гипоксию в родах. Не включали в изучаемую группу новорожденных, не имеющих признаков энтероколита.
Доношенных младенцев было 13 (23%), недоношенных – 45 (77%). Мальчиков было 36 (62%), девочек – 22 (38%).
Морфологическое исследование гистологических срезов кишечника произведено всем оперированным больным с некротизирующим энтероколитом. Детальный анализ архитектоники ткани тонкой и толстой кишки с морфометрией выполнен 22 пациентам.
Для гистологического изучения использовали санный микротом (pfm Slide 2003 – Sliding Microtome), микроскоп Niкon Eclipse E400 и камеру Niкon DS-Fi2, программное обеспечение NIS-Elements Basic Research.
На базе НИИ биомедицинских технологий ПИМУ в эксперименте на лабораторных крысах моделировали хроническую внутриутробную гипоксию плода.
В экспериментальной работе использованы 24 самки белых беспородных крыс с массой 156—230г, в возрасте от 4 до 10 мес. Лабораторные животные были разделены на 4 группы, по 6 самок в каждой. Группе I проводили гипоксию в первом триместре беременности (1-я неделя), группе II во втором триместре (2-я неделя) и группе III – в третьем триместре (3-я неделя). Параллельно проводимой гипоксии была отсажена группа IV контрольная, в которой особи не подвергались кислородному голоданию на протяжении всей беременности (21 день).
Для моделирования хронической гипобарической гипоксии крыс помещали в вакуумную проточную барокамеру, в условия соответствующие подъему на высоту 5000м со скоростью 25 м/сек. на 40 мин. по группам, ежедневно в течение 7 дней.
После родоразрешения потомство осматривали, затем выводили из эксперимента на 5 сутки жизни (срок, приближенный к клиническим проявлениям НЭК у новорожденных). Животных подвергали гексеналовому наркозу затем декапитировали.
Экспериментальное исследование проводили в соответствии с законодательством РФ («Правила гуманного обращения с лабораторными животными», «Деонтология медико-биологического эксперимент») и этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006г.) с разрешения Этического комитета НижГМА (протокол № 16, 2013г.).
Для световой микроскопии резецированных участков кишечника использовали микротом Leica SM 2000 R, микроскопы Topic (Бельгия, 2000) и Bio Blue (Нидерланды, 2013).
Выполняли морфометрическое исследование всех структур кишечной стенки, а также площадь микроциркуляторного русла на единицу площади брыжейки, толщину стенок кровеносных сосудов артериальной системы брыжейки.
Статистическую обработку производили с помощью пакета Stadiya 8,0, включающего критерии Вилкоксона, Ван дер Вардена и критерия знаков. Критическим уровнем достоверности при проверке статистических гипотез принимали р˂ 0,001. Данные морфометрического исследования рассчитывали по методам вариационной статистики и корреляционного анализа с использованием программы Excel, критерия Стъюдента, Kolmogorov-Smirnov, Манна-Уитни. Критическим уровнем достоверности при проверке статистических гипотез принимали р=0,05.
Результаты и обсуждения
Клинико-морфологические данные. Интраоперационно выявили, что постгипоксические изменения наиболее выражены в тонкой кишке - 37 (64%) случаев, структурную перестройку в стенке толстой кишки диагностировали у 13 (23%) пациентов, сочетанное поражение кишечника было у 8 (13%) больных.
Наряду с минимальными структурно-функциональными изменениями в кишечной стенке тонкой кишки отмечали участки с выраженной очаговой альтерацией слизистой оболочки, распространяющейся до мышечной пластинки. В наложениях на слизистую оболочку определяли фибрин, клеточный детрит, эритроциты. Эпителий отдельных крипт был резко уплощен, выявляли крипт-абсцессы, участки, лишенные крипт, что свидетельствовало о снижении активности регенераторного процесса в слизистой оболочке (рис. 1). В наиболее измененных участках слизистой оболочки определяли фибрин, полиморфноядерные лейкоциты, укороченные и расширенные ворсинки в подвздошной кишке, выраженную альтерацию эпителиального слоя.
В мышечной пластинке находили обширные геморрагии, с участками лизиса гладких миоцитов, дилятированные кровеносные сосуды, отек подслизистой основы, которая была инфильтрирована поли- и мононуклеарами. Периваскулярно выявляли микроочаговые геморрагии.
В области дефектов слизистой оболочки ворсинки и крипты отсутствовали. Слизистая оболочка сглаживалась, представляя собой обнаженную собственную пластинку, которая эпителизировалась со стороны сохранившихся участков «наползанием» вновь сформированного однотипного, упрощенного эпителия, лишённого высокоспециализированных клеток.
В участках изъязвлений определяли некротизированную ткань с диффузной лейкоцитарной и геморрагической инфильтрацией, прослеживали контуры некротизированных сосудов (рис. 2).
При исследовании стенки толстой кишки наблюдали локусы с выраженной очаговой альтерацией слизистой оболочки, распространяющейся, как правило, до мышечной пластинки, которая еще была сохранена на всем протяжении.
В зонах тотального некроза слизистой оболочки выявляли выраженное распространение последнего на мышечный слой и серозную оболочку, где находили фибринозно-гнойный экссудат. В наиболее измененных участках были наложения на слизистую оболочку фибрина и полиморфноядерных лейкоцитов.
При исследовании отмечали деструкцию мышечной пластинки слизистой оболочки, инфильтрацию подслизистой основы, наличие обширных очагов некроза, а также обширные геморрагии в собственной пластинке слизистой оболочки, подслизистой основе, в наружном слое мышечной оболочки (рис. 3).
Были выявлены язвы с подрытыми краями, проникающие до мышечного слоя (рис. 4). В последнем наблюдали фокусы лизиса, в субсерозном и серозном слоях, диффузную инфильтрацию нейтрофильными гранулоцитами, очаги некроза. На серозной оболочке отмечали наложения из лейкоцитов, фибрина, эритроцитов.
В собственной пластинке слизистой оболочки диагностировали выраженный отек. Известно, что для резорбции отека требуется хорошо действующий лимфатический отток. Однако во всех участках слизистой оболочки как толстой, так тонкой кишки находили нарушения крово - и лимфообращения, в виде расширенных сосудов со стазом эритроцитов, геморрагии (рис. 5, 6). Данные изменения пролонгировали экссудацию, с последующим образованием фибриновых тромбов.
Таким образом, на фоне обструктивного лимфангита, во многих лимфатических сосудах определяли массы лимфоцитов, что объясняло нарушение рециркуляции системно-органного уровня.
Морфометрическое исследование эпителиального пласта слизистой оболочки тонкой кишки выявило повышение числа нейтрофильных гранулоцитов 1,0±0,25, (р=0,051), эозинофильных гранулоцитов в эпителии крипт 5,6±0,59, (р=0,055), в криптальном эпителии снижено количество бокаловидных экзокриноцитов 12±0,9 , (р=0,0008).
В собственной пластинке слизистой оболочки клеточная плотность в участках с максимальными проявлениями воспалительного процесса достигала своего максимума до 12064 клеток на мм². Количество лимфоцитов в данных участках по сравнению с участками с минимальным воспалением увеличивалось в 2,7 раза (3749,8±120,19, р=0,0006), эозинофильных гранулоцитов в 2 раза (3374,8±40,01, р=0,0006), нейтрофильных гранулоцитов в 1,99 раза (494,4±11,90, р=0,0005), снижалось количество фибробластов – продуцентов экстрацеллюлярного матрикса. Отмечали снижение численности плазмоцитов в тонкой кишке в 1,23 раза (489,1±19,76, р=0,0024). Собственная пластинка ворсинок была отечная, определяли вазоэктазии.
В участках слизистой оболочки толстой кишки выявляли повышение количества межэпителиальных лимфоцитов в поверхностном эпителии в 1,3 раза (14,1±0,62, р=0,001), межэпителиальных эозинофильных гранулоцитов в поверхностном эпителии 1,86 раза (10,2±0,98, р=0,0001), снижение количества бокаловидных экзокриноцитов в поверхностном эпителии в 3,2 раза (6,1±0,44, р=0,0003).
Клеточная плотность в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки достигала 10426±108,7на мм² за счет увеличения лимфоцитов, эозинофильных гранулоцитов, нейтрофильных гранулоцитов.
Экспериментальное исследование. При завершении моделирования гипоксии и родоразрешения беременных самок отмечено, что наиболее сильно гипоксия отразилась на группе I, где родилось 16 крысят, двое из которых были мертворожденными, в группе III - 22 детеныша, из них 3 мертворожденные, в группе II – 28, в контрольной группе количество потомства составило 31. С меньшим весом родился приплод у самок группы II – 6,1±0,5, (р˂0,01).
Гистологическое исследование кишечника у крысят всех групп выявило снижение толщины слизистой и утолщение мышечной оболочек табл. 1.
Данные представленной таблицы указывают, что хроническая гипоксия, смоделированная в первый триместр беременности привела к развитию вторичной тканевой гипоксии в стенке кишки, снижению толщины слизистой оболочки, разрастанию соединительной ткани в мышечном слое (рис. 7).
Гипоксия, сформированная во втором периоде беременности, сопровождалась атрофией слизистой оболочки преимущественно за счет укорочения и уменьшения количества ворсин и увеличения соединительной ткани в собственной пластинке (рис. 8).
Хроническая гипоксия, смоделированная в третьем периоде беременности, была представлена снижением толщины слизистой оболочки за счет слущивания покровно-ямочного эпителия и формированием «голых» ворсин табл. 2.
Изменение соотношения между слоями стенки кишки приводили к сужению ее просвета, что особенно было показательно у животных первой группы табл. 3, (рис. 9).
Выраженное сужение просвета кишки отмечали у животных первой группы, что связывали с фиброзом средней оболочки. Во второй и третьей группах диаметр кишечной трубки был расширен.
Хроническая гипоксия, смоделированная в первый период беременности, приводила к компенсаторному расширению артериального фрагмента микроциркуляторного русла у потомства с последующим развитием хронического венозного полнокровия, при этом площадь венозной части увеличивалась вдвое. Гипоксия, созданная в поздние сроки беременности, сопровождалась венозным застоем с увеличением площади вен в три раза, что способствовало развитию атрофических и дистрофические изменений в эпителии слизистой оболочки табл. 4.
Заключение
Гипоксия – это ведущий предиктор в развитии некротизирующего энтероколита у новорожденных, тонкая кишка наиболее уязвима к воздействию этого фактора. Отмечено, что кислородное голодание, особенно в I триместре беременности, оказывает влияние на количество новорожденного потомства и его вес.
Анализ морфологической и морфометрической картины операционного и экспериментального материала убедительно доказывает, что под воздействием гипоксии происходит деструкция слизистой оболочки кишечника и разрастание соединительнотканного компонента в мышечном слое.
Изменения со стороны микроциркуляторного русла в виде крово - и лимфообращения провоцируют развитие предъязвенных, язвенных дефектов и формирование некрозов. Выявляемый повсеместно лимфатический отек является благоприятной почвой для инфицирования. Нарушение дренажной функции способствует дальнейшему распространению патологического процесса в стенке кишечника, а в последующем и к неблагоприятному исходу заболевания.

Irina Yuryevna Karpova

Рrivolzhskiy research medical university

Author for correspondence.
Email: ikarpova73@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4897-6702

Russian Federation, Minin Square and Pozharsky, 10/1, N. Novgorod, 603005, Russian Federation

M.D., associate professor, professor of the Department of Pediatric Surgery

Vyacheslav Vladimirovich Parshikov

Рrivolzhskiy research medical university

Email: parshikovvv43@mail.ru

Russian Federation, Minin Square and Pozharsky, 10/1, N. Novgorod, 603005, Russian Federation

M.D., professor, head of the department of pediatric surgery

Natalia Nikolaevna Prodanets

Рrivolzhskiy research medical university

Email: nnp.71@mail.ru

Russian Federation, Minin Square and Pozharsky, 10/1, N. Novgorod, 603005, Russian Federation

Ph.D., Senior Researcher, Morphology Department

Tatyana Ivanovna Solovieva

Рrivolzhskiy research medical university

Email: tis_27@mail.ru

Russian Federation, Minin Square and Pozharsky, 10/1, N. Novgorod, 603005, Russian Federation

Ph.D., Associate Professor, Senior Researcher, Department of Biochemistry

Evgenia Dmitrievna Pyatova

Рrivolzhskiy research medical university

Email: edpyatova@mail.ru

Russian Federation, Minin Square and Pozharsky, 10/1, N. Novgorod, 603005, Russian Federation

senior lecturer of the Department of Medical Physics and Informatics

Darya Vasilievna Molchanova

Рrivolzhskiy research medical university

Email: dashenka8723@mail.ru

Russian Federation, Minin Square and Pozharsky, 10/1, N. Novgorod, 603005, Russian Federation

assistant of the Department of Pediatric Surgery

Anastasia Alexandrovna Bebenina

Рrivolzhskiy research medical university

Email: anastasia.bebenina@yandex.ru

Russian Federation, Minin Square and Pozharsky, 10/1, N. Novgorod, 603005, Russian Federation

6th year student of pediatric faculty

  • Ovsyannikov V. G. General pathology: pathological physiology. Publishing house of Rostov state medical University of Minzdrav of Russia 2014 – Part I. General pathophysiology. - 361 p.
  • Zhang H. Y, Wang F., Feng J. X. An experimental study of acute neonatal enterocolitis. Chin Med. J. 2013; 126 (9): 1771-1778.
  • Zani A., Eaton S., Puri P. international survey on the management of necrotizing enterocolitis. Eur. J. Pediatr. Surg. 2015; 25: 27-33.
  • Mach M., M. Dubovickэ, Navarovb J., Brucknerovb I. Experimental modeling of hypoxia in pregnancy and early postnatal life. Interdisc Toxicol. 2009; 2 (1): 28-32.
  • N. Högberg, Per-Ola Carlsson, V. S., Hillered L. D., Stenbäck A. intestinal Intraluminal microdialysis defects markers of hypoxia and cell damage in experimental necrotizing enterocolitis. J. Pediatric Surgery. 2012; 47: 1646-1651.
  • Gordeeva A. E., Sharapov M. G., Novoselov V. I., Fesenko E. E., Temnov A. A., Khubutia M. sh., the Influence of peroxiredoxin VI on the preservation of the small intestine during ischemia/reperfusion. Transplantation 2014; 8: 21-27.
  • Balyemeza G., Sivaslib E., Ceylanc H., Tutard E., Ekize S., M. Tarakciogluf, Demiryurekg A. T., Coskun, M. Y. Protective effects of Y-27632 on hypoxia/reoxygenation-induced intestinal injury in newborn rats. J. Pediatr. Surg. 2011; 46: 1490-1494.

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Views

Abstract - 23

PDF (Russian) - 6


Copyright (c) 2018 Karpova I.Y., Parshikov V.V., Prodanets N.N., Solovieva T.I., Pyatova E.D., Molchanova D.V., Bebenina A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.