Experimental Modeling of Necrotizing Enterocolitis: Pathogenesis, Predictors, Prevention of the Disease

Full Text

На протяжении многих десятилетий некротизирующий энтероколит (НЭК) встречается с частотой 2,4:1000 новорожденных, что составляет 2,1% (в ряде случаев – 4%) среди всех детей, поступающих в неонатологические отделения интенсивной терапии [1, 2].
Количество осложнений достигает 51 – 68% [3, 4, 5]. Летальность варьирует от 4 до 20%, а при обширных некрозах кишечника может увеличиваться до 80% и выше [6].
Техническое оснащение реанимационной и анестезиологической служб дают возможность выхаживать младенцев с очень низкой и экстремально низкой массой тела (ОНМТ, ЭНМТ), у которых, из-за физиологических особенностей, клинические проявления НЭК диагностируют в отсроченном периоде.
В связи с этим, необходимо дальнейшее изучение патогенеза и ведущих факторов, провоцирующих развитие патологического процесса.
На современном этапе большое внимание уделяется профилактике энтероколита. Проводится поиск наиболее эффективных методов, позволяющих снизить уровень заболеваемости. Активно обсуждается роль грудного вскармливания, анализируются показания к применению пре- и пробиотиков.
Именно экспериментальная медицина помогает дать ответы на нерешенные вопросы с позиции доказательной науки, которые будут способствовать дальнейшему развитию педиатрии и детской хирургии.
Цель
Представить современные данные отечественных и зарубежных экспериментальных исследований, которые посвящены изучению некротизирующего энтероколита.
Патогенез и предикторы заболевания
В экспериментальной работе Caplan M.S. (2005) выявлено, что у недоношенного потомства крыс существует дисбаланс между выработкой провоспалительных и антивоспалительных медиаторов, данный факт рассматривают как фактор, предрасполагающий к развитию НЭК [7].
Ozdemir R. с соавт. (2012) выполнили изучение антиоксидантного действия N - ацетилцистеина (NAC) на состояние новорожденных крысят, которым моделировали энтероколит. Раствор NAC вводили внутрибрюшинно (125мг/кг) 1 раз в день в течение первых 4-х суток жизни, с последующим клинико-лабораторным и морфологическим контролем. Авторы отметили, что окислительный стресс и медиаторы воспаления играют роль в патогенезе НЭК. N - ацетилцистеин благодаря своим противовоспалительным и антиоксидантным свойствам оказывает защитное действие на стенку кишечника [8].
На мышах доказано, что при взаимодействии слизистой кишечника с медиаторами воспаления (флагеллином или липополисахаридом), запускается процесс активации развития кишечного эпителия, что способствует устойчивости к провоспалительным агентам [9].
Экспрессия внутриклеточного адаптерного белка (TIRAP) вызывает выработку провоспалительных цитокинов, приводящих к инициированию уровня интерферона типа I. Плод на поздних стадиях беременности, подвергается воздействию трофических факторов околоплодных вод, которые в целом способствуют созреванию кишечника [10].
Отмечено, что нарушение всасывания липидов является результатом снижения выработки множества факторов, включая желудочную липазу, кишечные внутрипросветные желчные соли и экзокринные гормоны поджелудочной железы. Имеет значение тот факт, что экспрессия кишечного эпителия должна уменьшаться с постнатальным развитием, однако у мышей при НЭК его уровень остается повышенным во всех отделах кишечника [11], при этом в антенатальном и раннем постнатальном (1 сутки) периодах зафиксирована экспрессия Toll-like рецептора 4 (TLR4) [12].
На новорожденных мышах изучен механизм взаимообратной связи кишечник-головной мозга. Выявлено, что блуждающий нерв способствует двунаправленной связи между кишечником и лимбическим отделом внутри центральной нервной системы (ЦНС). Гиппокамп является локусом внутри ЦНС, который в основном отвечает за контроль над работой кишечника. Кишечные микробы оказывают воздействие на развитие мозга через нервную систему желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Изменения в поведении связаны с микробным составом, так как некоторые продукты бактерий кишечника действуют как «нейронуклеомодули» и влияют на клетки мозга. Сигналы о микробах в кишечнике передаются в мозг и лимбическую систему. Блуждающий нерв связан с регуляцией цитокинов в кишечнике, что приводит к воспалению и бактериальной инвазии за счет утраты кишечным эпителием барьерной функции [13].
Штаммы C. perfringens типа A, полученные из аутопсийного материала жеребят, у которых моделировали энтероколит, продуцировали секреторный цитотоксин (порообразующий токсин NetF), опасный для клеток яичников лошадей. Большинство животных страдающих патологией были моложе трехдневного возраста, что подтверждало роль трипсин-ингибирующего действия молозива в противодействии расщеплению токсинов C.perfringens [14].
В научных исследованиях Warner B.B., Tarr P.I. (2016) отмечено, что грамотрицательные бактерии являются причиной патогенеза НЭК. В моделях на животных TLR4 играет центральную роль в повреждении слизистой оболочки, а антибиотики, активные против грамотрицательных бактерий, обеспечивают защиту. Кроме того, анаэробные бактерии в ответ на углеводы, доступные для микробиоты, генерируют противовоспалительные жирные кислоты с короткой цепью (ацетат, пропионат, бутират). Доказано, что аминогликозиды активны против Gammaproteobacteria в кишечнике, но не подавляют анаэробные бактериальные популяции [15].
В экспериментальных работах при помощи химических и генетических способов у мышей добивались истощения ацидофильных энтероцитов в кишечной стенке. Дефицит функции клеток Панета вызвал значительные изменения состава микробиома слепой кишки со значительным увеличением видов Enterobacteriacae, фенотипически сходных с теми, что наблюдали у пациентов с НЭК [16].
Shreyas K.R. с соавт. (2018) проводили моделирование НЭК у новорожденных поросят при помощи кормления их смесями ферментированными кишечной палочкой. При развитии патологического процесса у животных наблюдали повышенное содержание короткоцепочечных жирных кислот (SCFA), которые провоцируют повреждение кишечной стенки. Известно, что SCFA появляются в результате бактериальной ферментации негидролизованной лактулозы из-за незрелости кишечной лактазы [17].
В работах Wei J. с соавт. (2015) отмечена связь заболевания с потерей нейронов и глиальных клеток в нервной системе кишечника. Трансплантация нервных стволовых клеток (NSC) кишки в сочетании с гепарин-связывающим эпидермальным фактором роста (HB-EGF), позволяет защитить от экспериментального энтероколита. При введении новорожденным крысам, одного из представленных факторов, происходило снижение проницаемости кишечной стенки [18].
Исследования на животных моделях, показали, что эпидермальный фактор роста (EGF) является потенциальным биомаркером развития НЭК. EGF обнаруживают в амниотической жидкости, так же он вырабатывается железами ЖКТ (слюнными; Бруннера, локализующимися в двенадцатиперстной кишке), клетками Панета и макрофагами. EGF важен для снижения аутофагии, процессов деления и миграции в кишечнике. Введение крысятам мезенхимальных стволовых клеток с HB-EGF приводит к синергизму, который уменьшает травмы и улучшает выживаемость [19].
Jing S. с соавт. (2018) выявили, что у недоношенных поросят тяжелые формы НЭК связаны с острым воздействием на развивающийся гиппокамп. Прогрессирование патологии снижало физическую активность животных, особенно когда поражение локализовалось в тонкой кишке. Это коррелировало с повышением уровней маркеров нейровоспаления (S100A8, S100A9, IL8, IL6, MMP8, SAA, TAGLN2) и гипоксии (PDK4, IER3, TXNIP, AGER). На данном фоне экспрессия генов, связанных с защитой от окислительного стресса (HBB, ALAS2) и олигодендроцитами (OPALIN) была подавлена [20].
В работах Тихоновой Н.Б. с соавт. (2014), при проведении окклюзии сосудов брыжеечной аркады дистального отдела подвздошной кишки у маловесных поросят в течение 48 часов, морфологическая картина характеризовалась широким диапазоном изменений: от минимальных в виде эрозий слизистой оболочки и десквамации единичных эпителиальных клеток, до выраженных с некрозом стенки кишки с изъязвлениями, пневматозом, перфорацией и развитием перитонита. При уменьшении времени окклюзии и с проведением последующей реперфузии у доношенных поросят чувствительность к ишемии была меньше.
Отмечено, что восприимчивость к нарушению кровоснабжения кишечника у мышей оказалась значительно выше, чем у поросят. Связь между каким-то определенным видом микроорганизмов и НЭК у потомства не была установлена. Доказано, что в качестве агентов, повреждающих слизистую оболочку, могут выступать бактерии, в том числе относящиеся к нормальной флоре кишечника новорожденных, грибы, вирусы, вызывающие развитие гастроэнтероколита и респираторных заболеваний. Число заболевших животных с признаками НЭК было прямо пропорционально числу гипоксических и/или гипотермических сеансов воздействия. У потомства, находящегося на грудном вскармливании признаков заболевания не отмечено. [21].
По данным Zamora I.J. с соавт. (2015) у поросят, при прогрессирующем течении НЭК, отмечены низкие значения ближней инфракрасной спектроскопии (NIRS). Данный факт подтверждает мысль, что гипоксия, вызванная плохой перфузией и / или повышенным потреблением кислорода тканями, является основным звеном в патогенезе заболевания [22].
По мнению Caplan M.S. с соавт. (2005) комбинированное действие белков (казеина) и органических кислот при уровне рН менее 5,0 вызывает тяжелое повреждение кишечника, проявляющееся избыточной секрецией, некрозом ворсин, отеком кишечной стенки, кровоизлияниями и развитием трансмурального некроза [23].
Известно, что клаудин-2 создает катионселективные поры и увеличивает проницаемость в эпителии различных тканей, включая кишечник. Функция клаудина - 3 и - 4 в кишечнике мышей барьерная и её подавление коррелирует с развитием заболевания. Снижение экспрессии клаудина-7 может способствовать потере целостности тканей и формированию воспаления не только в ЖКТ, но и в почках. Поэтому возможно использовать экспрессию клаудина в качестве потенциального биомаркера НЭК [24].
Garg P.M. с соавт. (2015) выявили, что некротизирующий энтероколит в экспериментальной модели на мышах приводит к острому повреждению и воспалению почек, нарушению белков плотных соединений в органе. Белки группы клаудинов выполняют барьерную и водно-электролитную роль в стенке кишки. Умеренно повышенный уровень клаудина-7 в почках свидетельствует о том, что последние могут пытаться удерживать воду и преобразовывать уровни натрия и хлоридов в организме. Так же был повышен Аквапорин-2 (AQP2) - водный канал, играющий жизненно важную роль в регулировании водного баланса. Это говорит о том, что у крысят с НЭК почки пытаются увеличить реабсорбцию воды для поддержания сниженного внутрисосудистого объема. С другой стороны, изменения в экспрессии AQP2 также могут быть связаны с трансформацией системного осмотического давления (из-за кормления молочной смесью) или с нарушением процессов всасывания в кишечнике. Варьирование экспрессии клаудина-1, окклюдина (TJ-белки) помогает объяснить такие клинические особенности, как: олигурию, гипонатриемию и дисбаланс жидкости [25].
Повышение концентрации интерлейкина-12 (IL-12) и интерлейкина-18 (IL-18) при НЭК в экспериментальных исследованиях позволило установить зависимость между уровнями воспалительных цитокинов и степенью повреждения тканей [26].
В работе Kopperuncholan N. С соавт. (2017) отмечена взаимосвязь между тяжестью тромбоцитопении при моделировании НЭК у мышей со степенью повреждения. Так же, зафиксировано постоянное снижение количества тромбоцитов у потомства мышей с НЭК-подобным процессом через 15–24 часа после воздействия тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS - экстремальный окислитель, при смешивании ее с восстановителями (гидриды, сульфиды, нитриды), начинается активная реакция, завершающаяся детонацией). Патологическое состояние связано с увеличением количества тромбоцитов, ранним и устойчивым ростом уровня незрелой фракции тромбоцитов (IPF), после воздействия TNBS и повышенным числом / плоидностью мегакариоцитов в костном мозге [27].
В опыте на новорожденных крысятах был применен внутрипросветный микродиализ кишечника (ректосигмоидальная зона) с помощью которого исследовали признаки кишечной гипоксии и клеточных повреждений, с значительным повышение лактата и глицерина. Микроскопический анализ подтвердил обнаружение кишечной гипоксии в стенке кишечника при НЭК [28].
Способы профилактики
Исследования Rúdnei de O.L.G. с соавт. (2017) показали, что ишемическое прекондиционирование (r-IPC - экспериментальный метод для получения устойчивости к потере кровоснабжения), примененное у беременных крыс, приводило к снижению возникновения НЭК в толстой кишке у потомства. Характерной чертой r-IPC является наличие двух отдельных фаз защиты: ранняя, которая начинается сразу после реперфузии, с защитным действием в течение двух-трех часов, и поздняя, ​​которая проявляется между двенадцатью и двадцатью четырьмя часами после первоначальной реперфузии. Гуморальные и нейрональные медиаторы способствуют передаче и хранению информации, повышая толерантность клеток к последующему ишемическому повреждению на фоне дефицита пролиферативной активности в слизистой оболочке кишечника. Таким образом, более высокая встречаемость апоптоза из-за r-IPC определяет его защитный эффект, с сохранением слизистой оболочки кишечника, уменьшая тяжесть поражения [29].
У 61% детенышей крыс с НЭК применение легочного сурфактантного белка-A (SP-A) снижало смертность, так как уровни кишечных провоспалительных цитокинов были повышены. Введение SP-A уменьшало уровни IL-1b и фактор некроза опухоли-а (TFN-a), но мало влияло на показатели интерферона -g (IFN-g). SP-A лечение крысят, подвергшихся воздействию гипоксии, значительно сокращало экспрессию кишечного TLR4. Отмечено, что перорально вводимый SP-A способен проходить через ЖКТ, обеспечивая защиту незрелой кишки [30].
Моделирования Zhou W. с соавт. (2015) на крысах показали, что защитные эффекты human milk oligosaccharides (HMOs) против НЭК обусловлены специфическим изомером дисиалиллакто-N-тетраозы (DSLNT), а синтетические имитирующие HMO пребиотики - галактоолигосахариды (GOS), не способствуют профилактике заболевания. DSLNT модулирует различные ключевые факторы, участвующие в экспериментальном патогенезе НЭК. Доказано, что глютамин (Gln) является важным питательным веществом для пролиферации клеток кишечника и роста тонкой кишки. Исследования в экспериментах показали, что Gln обладает антиоксидантной защитой, способствует антиапоптозу и противовоспалительному действию [31].
Дотации бифидобактерий новорожденным крысятам ингибируют рост и размножение флоры, редуцируют стимуляцию бактериальных клеток слизистой оболочки кишечника (TLR2 , TLR4), тем самым уменьшают степень выраженности энтероколита [32].
Олигосахариды грудного молока (OHM), а именно 2’-фукозилактоза (2’FL - самый распространенный олигосахарид), может усиливать созревание кишечника и модулировать пути иммунной защиты. 2'-FL увеличивает рост бифидобактерий, подавляя Clostridia sp. и Enterobacteria sp. Кроме того, 2'-FL имеет структуру с фукозилированными H-антигенами в кишечном эпителии, к которым прилипают различные патогенные бактерии, включая Escherichia coli F18, которая является опасной для поросят, находящихся на искусственном вскармливании. Таким образом, кормление грудным молоком или смесями, содержащими 2’FL, сокращают риск развития некротизирующего энтероколита [33, 34].
Выявлено, что в группах крыс, получавших раннюю дотацию Lactobacillus murinus HF12, количество НЭК было меньше. Данный факт позволяет предположить наличие связи межу микробным пейзажем и развитием заболевания [35].
По мнению Tian F. с соавт. (2017) при добавлении в питательные смеси инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) у крыс с НЭК уменьшалась выраженность клинических симптомов. Авторы предполагают, что IGF-1 задерживает экспрессию мРНК толл-рецептора 4, что в свою очередь ингибирует производство медиаторов воспаления и усиливает продукцию муцина 1 и секреторного IgA [36].
Кишечная щелочная фосфатаза (IAP) представляет собой эндогенный белок, вырабатываемый эпителием кишечника. В опытной группе у потомства мышей дополнительная энтеральная IAP не защищала от повреждения кишечной стенки. Однако у взрослых особей, дотация IAP в начале воспалительного процесса поддерживала барьерную функцию кишечника и купировала его трансформацию [37].
У крысят, получающих полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) был пониженный уровень липополисахарида в плазме и редкое развитие патологического процесса, по сравнению с животными, которым давали смесь без PUFA. Более низкие показатели НЭК коррелировали со снижением экспрессии мРНК TLR4 во всех четырех сегментах кишечника у крыс, получавших PUFA. Эксперименты in vitro в том же исследовании продемонстрировали ингибирующее действие PUFA на рецептор фактора активации тромбоцитов в клетках подвздошной и толстой кишок, что обеспечивает еще один вариант защиты [38].
Shin S. с соавт. (2017) представили новый профилактический эффект японского растительного лекарственного средства Daikenchuto (TJ-100) при некротизирующем энтероколите у новорожденных у крыс. Daikenchuto представляет собой порошок высушенного корня имбиря, женьшеня и плодов зантоксилума в соотношении 5:3:2. В исследовании отмечены такие фармакологические эффекты как: повышение моторики нижних отделов ЖКТ, увеличение кровотока в тонкой кишке, снижение продукции воспалительных цитокинов. Применение Daikenchuto облегчает течение заболевания за счёт ингибирования синтеза IL- 6 [39].
Известно, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) A контролирует развитие микрососудов с помощью мощных ангиогенных, митогенных посредников, повышающих проницаемость сосудистого русла в кишечнике новорожденного потомства. Мышиное молоко содержит VEGF А и защищает от энтероколита. Пилотное исследование показало, что количество белка VEGF понижено у новорожденных мышей с выраженной клиникой заболевания [40].
Ингибитор киназы, ассоциированной с рецептором IL-1 (IRAK) способен ингибировать воспалительный ответ, за счет подавления толл-рецепторов. В ходе исследования у крыс было выявлено: уменьшение клинических проявлений НЭК, а также уровней TNF-a, IL-1b, IL-6, ядерного фактора каппа по сравнению с группами крыс, которые не получали IRAK.
Доказана значительная роль интерлейкина-10 в подавлении развития экспериментального энтероколита и предупреждении развития воспалительных заболеваний кишечника [41].
В группах доношенных и недоношенных животных, при моделировании энтероколита подтверждена профилактическая значимость пробиотиков, так как препараты обеспечивают штамм-неспецифическую защиту от воспалительного процесса [42, 43].
При инъецировании стволовых клеток AF крысам с НЭК, отмечена лучшая выживаемость в течение 7 дней, сокращение апоптоза в ворсинках кишки, снижение перекисного окисления липидов и инфильтрации нейтрофилов. Причиной данного действие опосредовано является индуцибельный механизм циклооксигеназы – 2 (COX-2 - фермент, участвующий в синтезе простаноидов) [44].
В работах зарубежных ученых при моделировании заболевания у новорожденных крысят убедительно подтверждена роль энтерального кормления. Сочетанное воздействие питания молочной смесью, гипоксии и бактерий, введенных в просвет ЖКТ, в 77% случаев приводило к возникновению НЭК, а летальность в данной группе составила 86%. При проведении этой же ситуации, но у недоношенных крысят НЭК развился в 75%, а летальность составила 100% [45].
Синдром короткой кишки является одним из ведущих осложнений при НЭК. Много исследований посвящено проблеме восстановления кишечной трубки для возобновления полноценного энтерального питания. Экспериментальная работа Хасанова Р.Р. с соавт. (2014) на животных моделях доказывает, что тонкая кишка может удлиниться при растягивании механической тягой и в дальнейшем нормально функционировать. Авторами разработана эндолюминальная удлиняющаяся капсула с полимерным покрытием - биоразлагаемое пружинное устройство, устанавливаемое под эндоскопическим контролем.
Так же выявлено, что глюкагоноподобный пептид 2 (GLP-2) обладает стимулирующим воздействием на эпителий кишечника. В тканевой инженерии используют матрицу из различных материалов. Матрикс заполняют клетками и имплантируют в васкуляризированное пространство реципиента. Обработанные специальным способом клетки кишечника - органоиды, помещают в матрикс, уложенный в сальник крысы. Некоторые авторы пытаются совместить матрицы и стволовые клетки В результате из органоидов образуются кистозные полости, гистологически напоминающие тонкую кишку, где в кишечном эпителии формируются зрелые крипты и ворсинки [46].
Заключение
Представленные механизмы патогенеза доказывают, что проблема некротизирующего энтероколита затрагивает все уровни организма от системного до клеточного, с развитием полисистемного комплекса осложнений. Выявленные факторы риска развития патологии и биомаркеры не только позволят своевременно распознать начало заболевания, но и оценить степень тяжести процесса. Безусловно, ведущей задачей в аспекте некротизирующего энтероколита является профилактика. Исследования на животных с позиций доказательной медицины подчеркивают роль грудного молока и применение пробиотиков в формировании естественной защиты организма.

About the authors

Irina Karpova

Privolzhsky Research Medical University

Author for correspondence.
Email: ikarpova73@mail.ru

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры детской хирургии 

Russian Federation, 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского. д.10/1 

Daria Molchanova

Privolzhsky Research Medical University

Email: dashenka8723@mail.ru

ассистент кафедры детской хирургии

Russian Federation, 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского. д.10/1 

Tatiana Ladygina

Privolzhsky Research Medical University

Email: ltm9652@gmail.com
Russian Federation, 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского. д.10/1 

References

Supplementary files