Experimental Modeling of the Ultra-Necrotic Stage of Critical Ischemia of the Lower Limbs

Full Text

Критическая ишемия нижних конечностей имеет тенденцию к неуклонному росту. Если в 20 веке она регистрировалась у 500 человек на 100тыс населения, то в 21 веке – у 1000 человек, т.е. имеет место двукратный рост патологии [1]. Прямые реконструктивные операции на артериях нижних конечностей возможны лишь у 75-80% пациентов, что обусловлено многоэтажным поражением и отсутствием воспринимающего русла. В 20-25% случаев применяются консервативное лечение и методы непрямой реваскуляризации: введение клеток костного мозга в ишемизированную конечность, поясничная симпатэктомия, реваскуляризирующая остеотрепанация [2]. Изучение эффективности лекарственных средств и непрямой реваскуляризации проводится на экспериментальных моделях критической ишемии.

В литературе описан ряд способов моделирования острой и хронической ишемии конечности. В порядке агрессивности модели целесообразно выстроить следующим образом.

Наиболее простым является моделирование хронической ишемии конечностей путем наложения на подвздошную артерию кетгутовой нити в виде спирали с сужением просвета сосуда на ½ диаметра. Хроническая ишемия возникает постепенно в результате набухания кетгутовой нити, что приводит к дальнейшему сужению просвета сосуда [3]. Развития критической ишемии не возникает, т.к. кетгутовая лигатура рассасывается в течение 2-3 недель и кровоток восстанавливается.

Для изучения влияния аутологических клеток костного мозга на течение хронической ишемии зарубежными авторами предложена модель ишемии путем перевязки бифуркации бедренной артерии. Кровоток прекращался по поверхностной и по глубокой артерии бедра. Развивалась хроническая ишемия нижней конечности, при экспериментальном лечении которой было установлено, что наибольшей эффективностью обладают мононуклеарные клетки костного мозга [4].

Более агрессивная модель была создана путем наложения четырех лигатур на магистральные артерии и вены животных. Для прекращения артериального кровотока лигатуры накладывались на подвздошную, бедренную и подколенную артерии, а для затруднения венозного оттока – на бедренную вену. Между лигатурами иссекалась и удалялась бедренная артерия. Применение данной модели позволяет получить клиническую картину хронической ишемии третьей стадии: конечность выключалась из передвижения, кожные покровы становились бледные и холодные. Однако ишемический отек и трофические расстройства не возникали [5].

Для лечения трофических язв артериального происхождения была разработана экспериментальная модель, сочетающая создание ишемии задней конечности животного путем лигирования подвздошной артерии и нанесением 2-3 кожных ран на стопе. Хроническая ишемия в этом случае развивалась в легкой степени и раны быстро заживали [6].

Более агрессивной является модель с перекрытием кровотока путем наложения лигатур на артерии 1-го и 2-го порядка от наружной подвздошной до подколенной артерии и на бедренной артерии ниже бифуркации [7]. У экспериментальных животных развивалась клиника хронической ишемии конечности III стадии, но трофические расстройства отсутствовали из-за компенсации кровотока по «vasa vasorum».

Ранее в нашей клинике для изучения влияния различных фармакологических препаратов и аутоклеток костного мозга на течение хронической ишемии конечности предложена резекционная модель, суть которой заключалась в иссечении бедренной, подколенной и начальных отделов передней и задней большеберцовых артерий. Отходящие от артерий коллатерали первого порядка пересекали и лигировали [8]. Модель позволяла воспроизвести критическую хроническую ишемию мышц голени. Однако трофические расстройства развивались редко.

 Преимуществами представленных моделей являлась возможность в условиях эксперимента изучать эффективность различных лекарственных препаратов на течение хронической ишемии конечности II - III стадии, а недостатком – отсутствие возможности создать хроническую ишемию IV стадии.

В патогенезе язвенно-некротической стадии критической ишемии особенно у больных сахарным диабетом кроме обструкции артериального русла большое значение имеет компенсаторное замедление оттока крови по венам нижних конечностей с развитием ишемического отека и ишемической нейропатии. Из клинической практики хорошо известно, что трофические расстройства мягких тканей развиваются при декомпенсации артериального и венозного кровотока, нарушении иннервации конечности. Поэтому целесообразно при моделировании критической ишемии вызывать не только нарушение артериального притока, но и замедление венозного оттока и периферическую нейропатию конечности.

Цель исследования: разработка способа моделирования язвенно-некротической стадии критической ишемии нижних конечностей.

Материалы и методы.

Экспериментальное исследование выполнено на 120 крысах - самцах линии «Wistar», разделенных на 4 группы по 30 особей в каждой. Исследование выполнено в соответствии с правилами проведения экспериментальных исследований на животных (Страсбург, 1986).

В первой группе (интактной) определяли уровень микроциркуляции в мышцах задней конечности. Во второй группе (ложнооперированной) выполняли  разрез кожи вдоль бедра по внутренней поверхности с выделением сосудисто-нервного пучка бедра и ушивание раны непрерывным швом. В третей группе (сравнения) моделирование хронической ишемии мышц голени производили путем удаления бедренной, подколенной, передней и задней большеберцовых артерий. В четвертой группе (опытной) для моделирования хронической критической ишемии мышц голени удаляли бедренную, подколенную, переднюю и заднюю большеберцовые артерии и вены, повреждали периферический нерв.

В опытной группе животное погружалось в наркоз внутрибрюшинным введением хлоралгидрата 300 мг/кг массы. Разрез выполняли от паховой складки до стопы по внутренней поверхности конечности. Вначале выделяли на всем протяжении бедренную. подколенную и берцовые артерии. Все отходящие коллатеральные ветви пересекали и лигировали. Иссекали бедренную, подколенную и берцовые артерии. Аналогичным образом выделяли бедренную, подколенную и берцовые вены. Впадающие коллатерали пересекали и лигировали. Удаляли магистральные вены конечности. Обнажали седалищный нерв и проводили его пересечение [9].

В послеоперационном периоде проводили наблюдение за динамикой симптомов ишемии конечности. Животных выводили из эксперимента по 10 особей в каждой группе путем передозировки наркоза хлоралгидрата на 10-е, 21-е и 28-е сутки. Перед выведением на тех же сроках определяли уровень микроциркуляции при помощи лазерной допплеровской флоуметрии. Значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ).Подробная методика определения уровня перфузии тканей изложена в предшествующей работе [10].

Для изучения морфологической картины на тех же сроках в третьей и четвертой группах иссекали ишемизированную икроножную мышцу голени и проводили стандартное гистологическое исследование.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета Microsoft Excel 2010. Достоверность отличий между показателями групп оценивали по критерию Манна-Уитни и Пирсона. При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты исследования

В первой и второй группах клинических признаков ишемии конечности не было.

Сравнительная характеристика клинической картины ишемии конечности в третьей и четвертой группе представлена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика клинической картины хронической ишемии

Table 1. Characteristics of the clinical picture of chronic ischemia

Симптомы экспериментальной ишемии конечности Experimental symptoms limb ischemia	Группа 3 (сравнения) Group 3 (comparisons)		Группа 4 (опытная) Group 4 (experimental)
	n=30	%	n=30	%
Ограниченное участие конечности в передвижении Limited limb involvement in motion	27	90	30	100
«Перемежающаяся хромота» "Intermittent claudication"	26	86,6	30	100
Гиперемия кожи конечности Hyperemia of the limb skin	19	63,3	28	93,3*
Сухая гангрена пальцев, части стопы Dry gangrene of the toes, parts of the foot	2	6,6	21	70*
Ишемический некроз Ischemic necrosis	1	3,3	17	56,6*
Ишемический отек Ischemic edema	1	3,3	30	100*

* - p <0.05 по сравнению с третьей группой

* - p <0.05 compared to the third group

 

Сразу после проведения эксперимента у животных в третьей группе развивалась острая ишемия: конечность выключалась из передвижения, кожные покровы становились бледные и холодные. Через 3-5 суток в третьей группе острая ишемия переходила в хроническую. Животное начинало наступать на оперированную конечность, развивалась перемежающая хромота, исчезали бледность, а похолодание сменялось гиперемией кожных покровов. Трофические расстройства в виде ишемических некрозов, отека и гангрены пальцев стопы развивались лишь у 13,3%.

У животных в четвертой группе острая ишемия сопровождалась развитием отека стопы и голени и отсутствием болевой чувствительности на оперированной конечности. Через 3-5 суток у всех животных появлялись симптомы язвенно-некротической стадии критической ишемии: нарастающий отек конечности, ишемические некрозы, трофические язвы, сухая гангрена пальцев стопы.

Динамика перфузии мышц голени в группах экспериментальных животных представлена в таблице 2.

Таблица 2. Динамика перфузии в мышцах голени (M±m) в перфузионных единицах

Table 2. Dynamics of perfusion in the leg muscles (M ± m) in perfusion units

 

Группа животных Group of animals	10 сутки (n=10)	21 сутки (n=10)	28 сутки (n=10)
Интактная Intact	528,6±11,4	531,6±12,08	533,4±11
Ложнооперированная Falsely operated	521,4±11,46	523±13,79	524,1±15,1
Сравнения Comparisons	213,6±7,53*	320,9±3,7*	376,7±10,68*
Опытная Experienced	160,5±3,28*   **	249,1±7,31*   **	302,9±6,46*   **

 * - p>0,05 в сравнении с интактной и ложно оперированной группами животных; ** - p >0,05 при сопоставлении с группой сравнения

 

 * - p>0,05 in comparison with intact and sham-operated groups of animals; ** - p >0,05 when compared with a comparison group

 

В интактной группе отмечены незначительные колебания уровня перфузии. В группе ложнооперированных животных среднее значение уровня микроциркуляции в мышцах  голени на всех сроках не имело достоверных отличий от показателей в группе интактных животных. В группе сравнения перфузия ишемизированных мышц голени была достоверно ниже, чем в группе интактных и ложно оперированных  животных: на 10-е сутки - в 2,5 раза, на 21-е сутки - в 1,7 раза и на 28-е сутки - в 1,4 раза. В опытной группе перфузия ишемизированных тканей была достоверно ниже не только значений интактной и группы ложнооперированных животных но и группы сравнения: на 10-е сутки в 1,3 раза, на 21-е в 1,3 раза, на 28-е сутки в 1,2 раза.

Динамика площади некроза в икроножной мышце представлена в таблице 3.

Таблица 3. Динамика площади некроза (%)

Table 3. Dynamics of the area of necrosis (%)

Группы животных Animal groups	10 сутки	21 сутки	28 сутки
Сравнения Comparisons	27,5±6	11±2,5	8,5±1,5
Опытная Experienced	48,7±8*	19,2±4,1*	15,3±2,7*

* - p <0.05 при сопоставлении с группой сравнения

* - p <0.05 when compared with a comparison group

 

В опытной группе площадь некроза в ишемизированной икроножной мышце была больше, чем в группе сравнения  на 10-е сутки на 21,2%, на 21-есутки - на 8,2% и на 28-е сутки – на 6,8% (p<0,05).

Динамика морфологической картины в ишемизированной икроножной мышце голени у животных третьей группы была следующая. На 10-е сутки в участках некроза клетки воспалительного ряда нейтрофилы и лимфоциты преобладали над клетками гистиоцитарного ряда – макрофагами и фибробластами, что свидетельствовало о наличии тяжелого воспалительного процесса. На 21-е сутки начиналось замещение погибших мышечных волокон грануляционной тканью. Клетки гистиоцитарного ряда начинали преобладать над клетками воспалительного ряда. На 28-е сутки интенсивность репаративного процесса увеличивалась за счет регенерирующих миобластов, участки некроза замещались элементами соединительной ткани.

В опытной группе на всех сроках эксперимента некротические и воспалительные изменения были более выраженными. На 10 сутки очаги некроза были полностью инфильтрированы нейтрофилами и лимфоцитами, клеток репаративного ряда не обнаруживалось. На 21 сутки на фоне участков некроза, инфильтрированных клетками воспаления, начали появляться единичные клетки репативного ряда. На 28 сутки в участках некроза мышечной ткани  клетки воспалительного ряда преобладали над клетками репаративного ряда.

Заключение. Полученные результаты позволяют констатировать, что предлагаемая нами модель критической ишемии конечности у крыс является максимально приближенной к таковой у человека при язвенно-некротической стадии облитерирующих заболеваниях артерий нижних конечностей. Это позволяет рекомендовать данную модель к использованию, как наиболее перспективную для оценки возможных способов коррекции данной патологии.

About the authors

Boris Semenovich Sukovatykh

Kursk state medical University

Author for correspondence.
Email: SukovatykhBS@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-2197-8756

Ph.D., Professor, head of chair of General surgery Kursk state medical University

Russian Federation, Kursk, Russian Federation

Elvin Eynulla Feyziev

Kursk State Medical University

Email: elvin251546@gmail.com

applicant for the Department of General Surgery

Russian Federation, st. K. Marksa, d3, Kursk, 305041, Russian Federation

Alexander Sergeevich Belous

Kursk State University

Email: a.s.belous@mail.ru

Ph.D., Senior Researcher, Research Laboratory "Genetics" Kursk State University

Russian Federation, st. Radishcheva, 33, Kursk, 305000 Russian Federation

Elena Vladimirovna Trubnikova

Kursk State University

Email: tr_e@list.ru

M.D., Head of the Research Laboratory "Genetics" Kursk State University

Russian Federation, st. Radishcheva, 33, Kursk, 305000 Russian Federation

Mikhail Borisovich Sukovatykh

Kursk State Medical University

Email: SukovatykhMB@kursksmu.net

Ph.D., Associate Professor of the Department of General Surgery, Kursk State Medical University

Russian Federation, st. K. Marksa, d3, Kursk, 305041, Russian Federation

Anzhelika Yurievna Orlova

Kursk State Medical University

Email: anzhelika_orlova@bk.ru

h.D., Assistant of the Department of General Surgery, Kursk State Medical University

Russian Federation, st. K. Marksa, d3, Kursk, 305041, Russian Federation

References

Supplementary files