Experimental Validation of the Use of Immobilized Form of Miramistin in the Treatment of Advanced Peritonitis

Full Text

Введение. Распространенный перитонит был, есть и будет одной из актуальных проблем абдоминальной хирургии. Несмотря на все успехи современной медицины летальность при этой патологии не удается уменьшить ниже 16%- 20% [1.2]. Попадание патогенной микрофлоры в брюшную полость вызывает образование перитонеального экссудата, содержащего большое количество экзо и эндо токсинов, всасывание которых ведет к массивному выбросу цитокинов эндотелием сосудов и клетками крови [3]. Провоспалительные цитокины повреждают  микроциркуляторное русло и нарушают перфузию жизненно важных органов, что приводит к развитию полиорганной недостаточности [4]. Поэтому в лечении перитонита важную роль принадлежит санации брюшной полости [5].

В Российских клинических рекомендациях по лечению острого перитонита не рекомендуется для промывания брюшной полости использовать водные растворы антисептиков по ряду причин. Во-первых, в связи с кратковременность воздействия и быстрой инактивации в условиях гнойного воспаления. Во-вторых, возможностью токсического воздействия на организм больного, так как для тщательной санации брюшной полости необходимо использовать от 2 до6 литров жидкости [6]. Поэтому большинство хирургов после промывания брюшной полости несколькими литрами дистиллированной воды или физиологического раствора для подавления оставшейся микрофлоры в нее вводят 200-300 мл водного раствора антисептика: фурациллина, хлоргексидина, диоксидина, гипохлорита и др. [7].

Оптимизация лечения перитонита  с нашей точки зрения может быть достигнута применением двух этапной санацией брюшной полости. На первом этапе выполняют чисто механическое удаление гнойного выпота, в котором содержатся микроорганизмы и их токсины с помощью  физиологического раствора. На втором этапе в брюшную полость вводится пролонгированная гелевая форма антисептика, обеспечивающая длительный антимикробный эффект и не подвергающаяся инактивации гнойным экссудатом.

В начале 21 века в нашей клинике была разработана и успешно применена на практике гелевая иммобилизированная форма гипохлорита натрия при лечении распространенного перитонита. Однако дальнейшие исследования показали. что гипохлорит натрия обладает цитотоксическим действием на лейкоциты угнетая иммунный статус пациента который при распространенном перитоните находится на низком уровне [8].

Одним из самых эффективных антисептиков является водный раствор 0,01% мирамистина. Отечественный антисептик эффективен в отношении грамм положительных и грамм отрицательных аэробных и анаэробных микроорганизмов, обладающих высокой резистентностью к антибактериальным препаратам, грибов и даже вирусов. Мирамистин обладает местным иммуностимулирующим действием. Сообщений о негативном влиянии мирамистина на иммунитет пациента не опубликовано. Пролонгированная форма препарата  для лечения распространенного перитонита до настоящего времени не применялась.

Цель исследования: экспериментальным путем изучить влияние иммобилизированной формы 0,01% мирамистина на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы на течение воспалительного процесса в условиях распространенного гнойного перитонита.

Материалы и методы. Экспериментальное исследование проводили на 288 крысах - самцах линии «Wistar» массой 200-250 гр. на базе лаборатории «Экспериментальной хирургии и онкологии НИИ экспериментальной медицины» ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России. Перед исследованием животные проходили 2-х недельный карантин для исключения сопутствующих заболеваний. Экспериментальное исследование проведено в соответствии с этикой и правилами проведения биомедицинских исследований с участием животных, утверждённых Конвенцией Совета Европы в 1986 году и приказом 267 Минздрава России от19.06 2003 года «Об утверждении правил лабораторной практики» Всем животным моделирование перитонита осуществлялось по методике  разработанного в клинике путем введения в брюшную полость животным 10% каловой взвеси (патент РФ на изобретение 2338265) [9]. Манипуляции на животных проводились под общим обезболиванием. В качестве средства для наркоза применялся эфир. Эвтаназию животных проводили путем передозировки наркотического средства

Перед операцией готовили пролонгированную форму мирамистина 0,01%, по следующей методике. 2 грамма порошка натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) заливали 100 мл раствора 0,01% мирамистина. Через 2 часа после набухания карбоксиметилцеллюлозы гель переливали во флакон емкостью 100 мл и стерилизовали в автоклаве под давлением в 1,1 атмосферу в течении 10 минут. После этого гель был готов к применению.

Животные были разделены на три группы, по 96 животных в каждой группе. Животным 1-й группы (контрольной) через 24 часа после введения каловой взвеси в асептических условиях производили лапаротомию и промывание брюшной полости физиологическим раствором. Животным 2-й группы (сравнения) на том же сроке на первом этапе вначале производили тщательную санацию брюшной полости физиологическим раствором с удалением гнойного выпота и пленок фибрина, а на втором этапе в нее вводили 5мл водного раствора 0,01% мирамистина. В 3-й (опытной) группе после лапаротомии и санации брюшной полости физиологическим раствором5 мл геля 0,01% мирамистина равномерно распределяли по всей поверхности брюшины (патент РФ на изобретение) [10].

На протяжении всего эксперимента проводили динамическое наблюдение за общим состоянием животных. Из эксперимента выживших животных выводили в конце 1, 3, 7 суток после операции по 5 особей в каждой группе, путем передозировки средств для наркоза.

Перед выведением животных из эксперимента производили забор крови для ее общего анализа и подсчета лейкоцитарного индекса интоксикации. После выведения животных из эксперимента в указанные сроки производили вскрытие брюшной полости. Оценивали характер и количество выпота. Экссудат брали на бактериологический посев с подсчетом количества микроорганизмов в 1 мл выпота. Подсчитывалась летальность животных в каждой группе. На гистологическое исследование брались участки: тонкой и толстой кишки, париетальной брюшины, поджелудочной железы, печени. Париетальная брюшина и органы брюшной полости подвергались гистологическому исследованию по общепринятой методике с фиксацией препаратов в нейтральном формалине, заливкой в парафин и окраской срезов гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону (пикро-фуксином).

Статистическую обработку проводили с использованием пакета Microsoft Excel 2010, вычисляли медиану, 25 и 75 перцентиль (Me (25; 75)). Достоверность отличий между показателями групп оценивали по критерию Манна-Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты и их обсуждение

Динамика показателей эндогенной интоксикации представлена в таблице 1.

Таблица 1 Динамика показателей эндогенной интоксикации у экспериментальных животных, Ме (25;75)

Table 1 Dynamics of indices of endogenous intoxication in experimental animals Ме (25;75)

 

Показатели / Indicators	Сутки / Day	Группы животных / Animal groups
		1 (n=96)	2 (n=96)	3 (n=96)
Лейкоциты *103мл.(здоровые животные 8,7*±0,5) / Leukocytes * 103ml. (Healthy animals 8.7 * ± 0.5)	1	20,1 (19,4;20,2)	16,2 * (15,5;16,6)	14,1 *  ** (13,4;14,5)
	3	19,2 (18,7;20,1)	12,5* (11,8;12,9)	9,6*   ** (8,9;10,02)
	7	17,3 (16,8;18,1)	10,1 *  (9,4;10,5)	8,4 *  ** (7,7;8,8)
ЛИИ усл.ед.(здоровые животные 1,3±0,3) / Leukocyte intoxication indexconventional units (healthy animals 1.3 ± 0.3)	1	8,1 (7,2;8,8)	5,1 *   (4,4;5,5)	4,1 *   ** (3,4;4,5)
	3	7,4 (6,4;7,9)	4,6 * (3,9;5,02)	2,9 *   **  (2,2;3,3)
	7	5,2 (4,3;6,2)	2,1* (1,4;2,5)	1,4*   ** (0,7;1,8)

*-p < 0,05 по сравнению с показателями первой группы

**-p< 0,05 по сравнению с показателями второй группы

Динамика лейкоцитарной реакции у животных первой группы свидетельствует о наличии активного гнойного воспаления в брюшной полости. При введении в брюшную полость раствора 0,01% мирамистина на 1-е сутки количество лейкоцитов было в 1,9 раза выше нормы, на 3-е сутки в 1,5 раза, на 7-е сутки в 1,2 раза. При введении иммобилизированной формы 0,01% мирамистинана основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы на 1-е сутки количество лейкоцитов было в 1,6 раза выше нормы, на 3-е сутки количество лейкоцитов было больше по сравнению с нормой в 1,1 раза, на 7-е сутки наблюдалась нормализация лейкоцитарной реакции. Аналогичным образом изменялся лейкоцитарный индекс интоксикации. Противовоспалительная активность иммобилизированной формы 0,01% мирамистинана основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы превосходила водный раствор мирамистина 0,01% на 1-е сутки – в 1,3 раза, на 3-е сутки – в 1,6 раза, на 7-е сутки – в 1,5 раза.

Результаты бактериологического исследования экссудата из брюшной полости представлены в таблице 2.

 

Таблица 2

Динамика количества микроорганизмов Ме (25;75), КОЕ*10^-3/мл

Table 1 Dynamics of the number of microorganisms Me (25; 75), CFU * 10^-3/ml

 

Сроки после операции / Terms after surgery	Группы животных
	1 (n=96)	2 (n=96)	3 (n=96)
1 сутки / 1 day	118,4 (116,4;122,3)	67,1 (65,7;70,1)*	53,9 (50,4;56,2)*   **
3	92,9 (90,3;94,5)	24,1 (21,4;26,2)*	11,7 (10,1;12,7)*   **
7	64,7 (62,8;66,7)	16,9 (14,1;18,4)*	9,7 (8,4;10,7)*  **

*-p <0,05 по сравнению с показателями первой группы

**-p<0,05 по сравнению с показателями второй группы

 

При бактериологическом исследовании количество микроорганизмов в 1 мл экссудата из брюшной полости на 1-е сутки после операции в группе сравнения было в 1,7, а в опытной группе в - 2,2 раза; на 3-е сутки эксперимента соответственно в 3,8 и 7,3 раза; на 7- сутки в 3,7 и 6,3 раза ниже чем в контрольной. При сопоставлении опытной группы и сравнения микробная обсемененность в опытной группе была на 1-е сутки ниже в 1,3 раза, на 3-е сутки – в 1,9 раза, на 7-е сутки – в 1,7 раза.

Динамика летальности в исследуемых группах животных представлена в таблице 3.

Таблица 3 Динамика летальности экспериментальных животных

Table 3 Dynamics of lethality in experimental animals

 

Сроки после операции / Terms after surgery	Группы животных / Animal groups
	1 (n=96)		2 (n=96)		3 (n=96)
	Абс / Abs. .	%	Абс.	%	Абс.	%
1 сутки / 1 day	58	60,4	39	40,6*	26	27*   **
3 сутки / 3 days	14	14,6	10	10,4*	7	7,3*   **
7 сутки / 7 days	9	9,4	7	7,3*	5	5,2*   **
Итого / Total	81	84,4	56	58,3*	38	39,5*  **

*-p <0,05 по сравнению с показателями первой группы

**-p<0,05 по сравнению с показателями второй группы

 

Из таблицы видно, что на 1-е сутки эксперимента в группе сравнения летальность была в 1,5 раза, а в опытной в 2,2 раза; на 3-е сутки эксперимента соответственно в 1,4 и 2 раза; на 7-е сутки в 1,3 и 1,8 раза ниже, чем в контрольной группе. При сопоставлении опытной группы и сравнения уровень летальности в опытной группе был на 1-е сутки ниже в 1,5 раза, на 3-е сутки и 7-е сутки – в 1,4 раза.

Многоэтапное комплексное морфологическое исследование проводилось на 1-е, 3-и и 7-е сутки эксперимента. У животных контрольной группы гистологическая картина на этих сроках подробно описана нами ранее в предшествующей работе и характеризовалась стадийностью патоморфологических изменений в брюшине в различные фазы течения перитонита [11].

 

 

А                                                                               Б

Рис.1 Микрофотография среза передней брюшной стенки в области париетального листка брюшины на 1 сутки после оперативного вмешательства: А – санация раствором мирамистина. Б - санация гелем мирамистина. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х400.

Fig. 1 Micrograph of a section of the anterior abdominal wall in the area of the parietal leaf of the peritoneum on day 1 after surgery: A - sanitation with miramistin solution. B - sanitation with miramistin gel . Stained with hematoxylin and eosin. Uv. x400.

 

 

При микроскопическом изучении гистологических срезов передней брюшной стенки со стороны брюшной полости на 1 сутки после санации водным раствором мирамистина, в области париетального листка брюшины визуализировались рыхло расположенные коллагеновые волокна, между которыми определялись клетки фибробластического дифферона и воспалительного компонента. Плотность клеток высокая. Среди клеточного состава, в поле зрения, преобладали лимфоциты, нейтрофилы, моноциты и единичные макрофаги (рис. 1А).

При микроскопии срезов толстого кишечника было отмечено, что слизистая и подслизистая оболочки без выраженных деструктивных изменений. При изучении мышечной оболочки, обращало на себя внимание наличие реактивно измененных ганглиев межмышечного нервного сплетения (Ауэрбаховского сплетения). Ганглии крупных размеров, содержали гиперхромные нейроны, с признаками отека цитоплазмы и чередующиеся со сморщенными нормо- и гипохромными нейронами.

При изучении срезов поджелудочной железы хорошо визуализировались ацинусы с ярко выраженными зимогенной и гомогенными зонами. Островки Лангерганса без реактивных изменений. При этом, следует отметить, что эпителий висцерального листка брюшины был реактивно изменен, клетки набухшие, их форма варьировала от плоской до кубической. Под мезотелием в рыхлой соединительной ткани определялись признаки интерстициального отека.

Гистологическая картина висцеральной и париетальной брюшины свидетельствовала о наличии активного резко выраженного воспалительного процесса.

При микроскопическом изучении гистологических срезов передней брюшной стенки со стороны брюшной полости, на 1 сутки после санации гелевой формой мирамистина, в области париетального листка брюшины визуализировались рыхло расположенные коллагеновые волокна, между которыми определялись клетки фибробластического дифферона и воспалительного компонента. Плотность клеток высокая. В поле зрения преобладали тучные клетки в стадии накопления секрета и макрофаги. Визуализировались единичные лимфоциты и нейтрофилы (рисунок 1Б).

Микроскопия срезов стенки толстого отдела кишечника выявила обильную круглоклеточную инфильтрацию, как в слизистой, так и в подслизистой оболочках. Относительно мышечной оболочки без особенностей. Однако, следует отметить, что в некоторых участках определялось утолщение серозной оболочки и скопление в них клеток фиброцитарного, макрофагального и воспалительного рядов.

При изучении срезов поджелудочной железы обращало на себя внимание наличие утолщенного, с признаками отека, висцерального листка брюшины, в толще которого преобладает клеточный компонент. Среди клеток визуализировались преимущественно нейтрофилы, лимфоциты и единичные макрофаги.

Морфологическая картина через сутки после санации гелевой формой свидетельствовала о выраженном воспалительном процессе в париетальной и висцеральной брюшине. Существенных различий между опытной группой и сравнения на этом сроке нет.

 

 

А                                                                   Б

Рис. 2 Микрофотография среза передней брюшной стенки в области париетального листка брюшины на 3 сутки после оперативного вмешательства: А - санация раствором мирамистина». Б – санация гелем мирамистина. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х400.

Figure: 2 Micrograph of a section of the anterior abdominal wall in the area of the parietal layer of the peritoneum on the 3rd day after surgery: A - sanitation with miramistin solution. B - sanitation with miramistin gel. Stained with hematoxylin and eosin. Uv. x400.

 

Гистологическое исследование париетального листка брюшины на 3-е сутки эксперимента после санации водной формой выявило увеличение признаков нарастания морфологических изменений в сторону воспаления. В частности, наблюдалась инфильтрация клетками воспалительного ряда (нейтрофилы и лимфоциты) соединительной ткани брюшины и прослоек между симпластами скелетной мышечной ткани. Выражены признаки отека интерстиция соединительной ткани. Со стороны микроциркуляторного русла наблюдалось выраженное кровенаполнение и капилляростаз (рис. 2А).

При исследовании срезов толстого кишечника структурных изменений в слизистой, подслизистой, мышечной оболочках не выявлено. Однако, в межмышечных ганглиях наблюдалось преобладание гиперхромных нейронов. В висцеральном листке брюшины, покрывающем толстый кишечник отмечалось наличие реактивных изменений в мезотелии, которые выражались в изменении формы мезотелиоцитов от плоской до кубической и высокой призматической, отеке цитоплазмы и гибербазофилии. Со стороны кровоснабжения толстого кишечника обращало на себя внимание расширение кровеносных сосудов венозного русла с краевым стоянием лейкоцитов, так называемый «краевой пул» и выход клеток крови лейкоцитарного звена в окружающую соединительную ткань.

Изучение срезов поджелудочной железы также выявило наличие круглоклеточной инфильтрации в области соединительной ткани покрывающей ее капсулы и висцеральной брюшины, кровенаполнение кровеносных сосудов с признаками тромбоза. Среди клеток в поле зрения преобладали нейтрофилы, лимфоциты и макрофаги. Определялись единичные тучные клетки в стадии накопления секрета. Инфильтрации стромы нет, паренхима органа без особенностей.

Через 3 суток после санации водным раствором в париетальной и висцеральной брюшине сохранялась картина выраженного воспаления.

На 3-и сутки после санации гелевой формой в области париетального листка брюшины отмечалось наличие признаков воспаления – высокая плотность клеток, среди которых преобладают клетки гранулоцитарного ряда. В большинстве срезов наблюдалось подпаивание к париетальному листку брюшины серозных оболочек органов брюшной полости (рис. 3Б).

В стенке толстого кишечника наблюдается круглоклеточная инфильтрация не только слизистой и подслизистой оболочек, но и мышечной оболочки. Со стороны межмышечного нервного сплетения реактивных изменений не выявлено. Висцеральная брюшина без патологии, мезотелиоциты плоские без признаков реактивно-деструктивных изменений.

Со стороны поджелудочной железы следует отметить наличие интерстициального отека в области капсулы и наличие в ее толще клеток воспалительного ряда с преобладанием в поле зрения нейтрофилов и лимфоцитов. При этом, обращала на себя внимание сохранность мезотелия на фоне увеличения размеров клеток.

На этом сроке после применения гелевой формы в париетальной брюшине сохранялся умеренно выраженный воспалительный процесс и постепенное снижение его интенсивности в висцеральной брюшине.

 

 

А                                                                               Б

Рис. 3 Микрофотография среза передней брюшной стенки в области париетального листка брюшины на 7 сутки после оперативного вмешательства: А - санация раствором мирамистина. Б –санация гелем мирамистина. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х400 (Б).

Figure: 3 Micrograph of a section of the anterior abdominal wall in the area of the parietal layer of the peritoneum on the 7th day after surgery: A - sanitation with miramistin solution. B - sanitation with miramistin gel. Stained with hematoxylin and eosin. Uv. x400 (B).

 

На 7-е сутки после санации водным раствором в срезах передней брюшной стенки со стороны париетального листка брюшины в соединительной ткани определялось значительное количество тучных клеток, находящихся в стадии дегрануляции и умеренное количество клеток воспалительного ряда. В участках сращения париетального листка брюшины с сальником или брыжейкой, так же, наблюдалось большое количество тучных клеток, как в стадии дегрануляции, так и в стадии накопления секрета (рис. 3А).

Изучение слизистой и подслизистой оболочек толстого отдела кишечника не выявило деструктивных изменений. В межмышечных ганглиях мышечной оболочки продолжают в поле зрения преобладать гиперхромные нейроны, при этом, признаков перицеллюлярного отека нет. Мезотелий образован плоскими клетками, без признаков воспаления и реактивных изменений.

В области поджелудочной железы продолжает сохраняться круглоклеточная инфильтрация стромы органа. В поле зрения преобладают лимфоциты и нейтрофилы. При этом, паренхима органа сохранна, хорошо визуализируются ацинусы с четко выраженными зимогенной и гомогенной зонами.

Через 7 суток после санации водным раствором динамика течения перитонита положительная. Однако, воспалительный процесс полностью не купирован.

Через 7 дней от начала эксперимента, было выявлено что, санация гелевой формой мирамистина привела к стиханию воспалительного процесса в париетальной брюшине, что выражалось в значительном снижении плотности клеток и изменении их качественного состава. В поле зрения визуализировались преимущественно клетки фибробластического дифферона и единичные лимфоциты. Мезотелий был без особенностей (рис. 3Б).

В области толстого кишечника в толще мышечной оболочки в поле зрения продолжали визуализироваться единичные лимфоциты. В области серозной оболочки, наблюдалось увеличение и утолщение волокон соединительной ткани (определялись признаки фиброза серозной оболочки), на фоне неизмененной формы мезотелиоцитов, что свидетельстовало о ликвидации воспаления висцеральной брюшины.

В соединительнотканной капсуле поджелудочной железы продолжала сохраняться круглоклеточная инфильтрация с преобладанием в поле зрения лимфоцитов и тучных клеток в стадии накопления секрета. Паренхима органа не изменена, хорошо визуализируются экзокринная и эндокринная части. Воспалительный процесс в паренхиматозном органе завершен.

Мирамистин по своей химической структуре относится к четвертичным аммониевым соединениям, которые являются катионными антисептиками. Поверхностно активные вещества разрывают наружную оболочку микробной клетки, приводя ее к гибели. Мирамистин легко иммобилизируется на карбоксиметилцеллюлозы, что делает возможным создания его гелевой формы. При смешивании мирамистина и кабоксиметилцеллюлозы не образуется новая лекарственная форма, а возникает лишь пролонгация лечебного действия антисептика. Проведенные ранее исследования показали, что лечебный эффект пролонгированных антисептиков длится 3-4 часа, тогда как их водных растворов не превышает 20-30 минут [12]. При введении в брюшную полость животных антисептик равномерно распределяется по всей ее площади, покрывая как висцеральную так и париетальную брюшину. Результаты нашего исследования достоверно показали преимущество гелевой формы антисептика мирамистина над его водным раствором в лечении распространенного экспериментального перитонита. Противовоспалительная эффективность гелевой формы превосходила водную в 1,5 раза, а противомикробная-в 1,7 раза, что позволило снизить летальность в 1,4 раза к концу эксперимента. Кроме этого гелевая форма антисептика на карбоксиметилцеллюлозе обладает противоспаечным действием, что при лечении перитонита особенно важно [13].

Заключение.

Результаты исследования свидетельствуют о высокой противовоспалительной и антимикробной активности иммобилизированной формы 0,01% мирамистина на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, что позволяет рекомендовать ее применение в клинической практике.

 

Дополнительная информация

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Финансирование.

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Курского государственного медицинского университета. Финансовой поддержки со стороны компаний-производителей медицинского назначения авторы не получали.

Одобрение комитета по этике.

Положительное заключение на экспериментально-клиническое исследование регионального этического комитета Курского государственного медицинского университета получено 05.03.2018 года, протокол №2.

 

About the authors

Boris Semenovich Sukovatykh

Kursk state medical University

Author for correspondence.
Email: SukovatykhBS@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-2197-8756

Ph.D., Professor, head of chair of General surgery Kursk state medical University

Russian Federation, Russia

Maria Alekseevna Zatolokina

Kursk state medical University

Email: zatolokinama@kursksmu.net

M.D., Professor of the Department of Histology, Embryology, Cytology

Russian Federation, Russia

Anastasiya Viktorovna Mosolova

Kursk state medical University

Email: mosolovaav@kursksmu.net

Assistant of the Department of General Surgery, Kursk State Medical University

Russian Federation, Russia

References

Supplementary files