Morphofunctional Changes of the Spleen after Hemostasis by «Nonequilibrium Plasma»

Повреждение селезенки при открытых травмах живота встречаются в 7%, при закрытых травмах живота – в 26% случаев [5]. При повреждении селезенки развивается обильное кровотечение, которое нередко приводит к летальному исходу. Одним из методов спасения жизни пациента является спленэктомия, которая выполняется при открытых травмах живота в 27%, при закрытых травмах живота – в 56,7% случаев [5, 6].

Остановка кровотечений может достигаться за счет швов, специальных клипс, клеевых аппликаций, применения гемостатических препаратов, термической или электрокоагуляции [3-6, 8-10]. В настоящее время в хирургии отдается предпочтение электрокоагуляции [12, 13]. Однако она может привести к термическим ожогам и некрозам, а также к формированию рубца, приводящего к нарушению функции органа.

Одним из современных методов гемостаза является метод, основанный на применении «неравновесной» плазмы, ее температура колеблется от 40 до 70°C. Для остановки паренхиматозных кровотечений нашим коллективом предложен аппарат «ИХП-1», разработанный на кафедре ПФ ФТФ ТПУ (г. Томск), который генерирует «низкотемпературную» плазму (≤ 45°C, амплитуда импульсов – 15 кВ, частота следования – 5 кГц) из атмосферного воздуха под действием барьерного разряда. Было установлено, что плазма, полученная таким способом, содержит большое количество активных составляющих (таких как ОН, NO, N2+, атомарный кислород и др.) [2].

Цель исследования: изучить влияние «неравновесной плазмы» на систему гемостаза и морфофункциональное состояние селезенки.

Материалы и методы

Проведение исследования одобрено этическим комитетом СибГМУ (г. Томск) (протокол № 2029 от 20 июня 2011 г.). Эксперимент проводили на 45 кроликах-самцах массой 3000 – 3200 г. Животные разделены на 2 группы исследования. В 1-ю группу (контрольную; n=5) вошли интактные животные без оперативного вмешательства; во 2-ю группу (экспериментальную, n=40, по 5 животных на каждую контрольную точку) – животные после атипичной резекции селезенки и гемостаза «неравновесной плазмой». Контрольные точки после оперативного вмешательства – 60 мин., 3, 5, 7, 14, 30, 90, 180-е сут.

Анестезию у кроликов осуществляли однократным внутривенным введением раствора Zoletil-100® (производство Virbac, Франция) из расчета 0,05 мл на 1 кг массы тела экспериментального животного в сочетании с препаратом Xylavet (производство Венгрия) из расчета 0,15 мл на 1 кг массы тела экспериментального животного.

Доступ к селезёнке осуществляли верхнесрединной лапаротомией с последующим выведением селезенки и поперечным удалением 1/3 селезенки [7]. Гемостаз производили при помощи аппарата «Источник холодной плазмы-1» с определенными параметрами. После остановки кровотечения селезёнку погружали в брюшную полость, рану послойно зашивали нитью Vicryl 4/0, затем накладывали повязку. Летальные исходы среди экспериментальных животных отсутствовали.

После выполнения оперативных вмешательств определяли объем кровопотери стандартным гравиметрическим методом. Плотность крови грызунов составляет 1,051.

Выведение животных из эксперимента в определенные контрольные точки при помощи CO2 – асфиксии в специализированной камере.

В контрольные точки у экспериментальных групп животных забирали венозную кровь для проведения общего анализа крови (ОАК) и кусочки ткани селезенки для осуществления гистологического и цитологического исследований.

Обзорную микроскопию и морфометрию осуществляли на микропрепаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Для оценки выраженности фиброза использовали окраску пикрофуксином по Ван-Гизону. Полученные препараты селезенки изучали с использованием бинокулярного светового микроскопа Carl Zeiss Axioskop 40 FL. При обзорной световой микроскопии оценивали воспалительные, дисрегенераторные (пролиферацию, гиперплазию), а также фиброзные процессы. С помощью цифровой фотокамеры Canon Power Shot A 630 производили съемку гистологических препаратов (7–10 случайных полей зрения для каждого среза). Цифровые фотографии подвергали морфометрическому исследованию с использованием программы ImageJ 1.43 с оценкой удельных объемов (УО) (мм3/мм3) красной и белой пульпы, сосудов и соединительной ткани. При помощи Plugins «Cell» программы ImageJ на 1 мм2 подсчитывали плотность клеточного инфильтрата.

Кусочки ткани селезенки животных использовали для приготовления мазков-отпечатков с последующей микроскопией. Отпечатки селезенки выполняли по стандартной методике с окраской азур-II и эозином по Нохту – Максимову.

Статистический анализ проводили с использованием статистического пакета Statistica 6.0. Применяли критерии Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни, для оценки значимости различий при пороговом уровне значимости p=0,05.

Результаты и их обсуждение

Достижение гемостаза селезенки при экспериментальном вмешательстве наступало через 1,5-2 мин. после обработки плазменным потоком кровоточащей поверхности. Объём кровопотери в ходе оперативного вмешательства составил 16,6 [15, 98;17, 22] мл.

Всем животным из экспериментальной группы проводили ОАК до 30-х сут. исследования, так как к 30-м сут. показатели нормализовались. В ходе эксперимента было установлено, что на 3-и сут исследования отмечалось статистически значимое повышение относительного количества сегментоядерных нейтрофилов до 38 [24; 39] (группа контроля 17 [13;18], p=0,009) и моноцитов до 15 [14;18] (группа контроля 8[6;11], p=0,036). В остальные сроки достоверных изменений исследованных показателей не выявлено.

В гистологической картине на 3-и сут. отмечаются явления отека, разволокнение коллагеновых волокон, очаговый полиморфно-клеточный инфильтрат, а также образование сладж-комплексов и стаза сосудов микроциркуляторного русла (рис. 1).

К 5-м и 7-м сут. отмечается изменение структуры красной и белой пульпы за счет отека. В белой пульпе отечная жидкость вокруг лимфатических фолликулов. В некоторых участках органа выявляется выраженное расширение центральной вены с признаками набухания эндотелиоцитов и гипертрофией гладкомышечных клеток в ней (рис. 2).

На 7-е сутки отчетливо определялось утолщение капсулы селезенки за счет отека и разволокнения коллагеновых волокон. К 14-м и 30-м сут. в белой пульпе между фолликулами определяется небольшое количество отечной жидкости. Вокруг центральной артерии селезенки расположены пучки коллагеновых волокон (рис. 3). В красной пульпе синусоидные капилляры расширены, между ними определяются пучки коллагеновых волокон, единичные скопления сегментоядерных нейтрофилов.

К 90-м сут. наблюдается полное разрушение красной и белой пульпы, нет границ между этими структурами. В белой пульпе невозможно идентифицировать фолликулы, а лимфоциты и плазматические клетки расположены диффузно. Выраженные признаки фиброза (рис. 4).

На 180-е сут определяется селезенка обычного строения. В ней можно выделить красную и белую пульпу. Соединительнотканная капсула типичного строения (рис. 5).

При анализе независимых данных (больше двух групп исследования) с использованием критерия Крускала-Уолиса было выявлено, что все морфометрические показатели имеют статистически значимые различия во всех группах (р˂0,05). При оценке данных экспериментальной группы и группы контроля на 3-е сут выявлено статистически значимое различие по следующим показателям: УО белой (р=0,0001) и красной пульпы (р=0,003) уменьшились на 46,9% и 12,5%, а УО сосудов, напротив увеличился в 3 раза по сравнению с данными контрольных животных (таб. 1).

К 5-м и 7-м сут. отмечается статистически значимое (р=0,0001) увеличение УО соединительно ткани до 9,42 [7, 79;18, 0], УО белой пульпы на 5-е сут статистически ниже контроля (р=0,0001), а к 7-м сут восстанавливается до контрольных величин. Показатель УО красной пульпы продолжает снижаться (р=0,002) и составляет 34,12 [29, 69; 44, 65], а показатель УО сосудов незначительно снижается по сравнению с предыдущим сроком (таб. 1). На 14-е сут и 30 сут показатель УО красной и белой пульпы статистически значимо снижается (р=0,0001) до 19,41 [18, 22;24, 23] по сравнению с предыдущими сроками и контрольной группой. В то же время на данных сроках показатель УО сосудов и соединительной ткани достоверно (р=0,0001) увеличивается и достигает своего максимального значения 18,26 [12, 26; 20, 83] и 52,42 [48, 44; 57, 83], соответственно (табл. 1).

К 90-м сут. среди показателей УО красной и белой пульпы отмечается тенденция к восстановлению (р=0,0001), однако в последний контрольный срок на 180-е сут данные показатели остаются достоверно (р=0,0001) ниже контрольных и составляют 22,95 [20, 5; 26, 5] и 50,96 [47, 24; 56, 57], соответственно. Показатель УО соединительной ткани имеет схожую динамику и к 180-м сут (р˂0,05) снижается в сравнении с предыдущими сроками, однако остается выше показателей контроля (табл. 1).

Анализ спленограмм (табл. 2, рис. 6) выявил статистически значимое (p=0,023) снижение лишь относительного количества малых лимфоцитов на 28% у животных после гемостаза неравновесной плазмой по сравнению с контрольными кроликами (23,3 [17, 9; 26, 7] против 30,8 [29, 25; 34, 3] в контроле).

Ряд исследователей проводили сравнительные экспериментальные работы по оценке повреждающего действия коагуляторов, наиболее современной работой можно считать работу учёных из университета Ганновера Thomas Carus и Klaas Rackebrandt, связанную с оценкой монополярного, биполярного, «холодно-плазменного» и ультразвукового коагуляторов (Carus T. and Rackebrandt K., 2011). В своей работе они пришли к выводам, что гемостаз может быть достигнут монополярной, биполярной и «холодно-плазменной» коагуляцией. Биполярный метод является наиболее эффективным с минимальным повреждающим действием [12]. В то же время Fridman G. 2006 и Kalghatgi S. 2007 в своих работах рассматривают «неравновесную плазму» как селективный метод коагуляции с отсутствием ожогов и глубоких повреждений [11, 14-16].

Ряд исследователей проводили сравнительные экспериментальные работы по оценке повреждающего действия коагуляторов, наиболее современной работой можно считать работу учёных из университета Ганновера Thomas Carus и Klaas Rackebrandt, связанную с оценкой монополярного, биполярного, «холодно-плазменного» и ультразвукового коагуляторов (Carus T. and Rackebrandt K., 2011). В своей работе они пришли к выводам, что гемостаз может быть достигнут монополярной, биполярной и «холодно-плазменной» коагуляцией. Биполярный метод является наиболее эффективным с минимальным повреждающим действием [12]. В то же время Fridman G. 2006 и Kalghatgi S. 2007 в своих работах рассматривают «неравновесную плазму» как селективный метод коагуляции с отсутствием ожогов и глубоких повреждений [11, 14-16].

Воздействие «неравновесной плазмы» при оперативных вмешательствах на селезенке приводит к эффективной и полной коагуляции за счёт комплексного воздействия на систему гемостаза [15]. При этом непосредственного контакта электрода с обрабатываемой поверхностью не происходит, а также не образуется струп, что нивелирует все отрицательные эффекты, связанные с припаиванием тканей к электроду коагулятора с последующим отрывом струпа и рецидивом кровотечения. Таким образом, коагуляция раневой поверхности селезенки плазменным потоком в эксперименте в течение 1,5-2 мин позволяет выполнять органосохраняющие операции с минимальным травматическим эффектом.

На 3-е сут. после воздействия «неравновесной плазмой» на паренхиму селезенки отмечаются выраженные сосудистые изменения с нарушением структуры белой и красной пульпы, которые постепенно уменьшались на 7-е сут., что может быть связано с угнетением экссудативной фазы воспаления и восстановлением лимфоидных фолликулов. Однако на 14-е сут. исследования в паренхиме селезенки отмечалось увеличение УО соединительной ткани и сосудов, что вероятно, связано с развитием «молодой соединительной ткани» и большим количеством кровеносных сосудов. Важно отметить, что на 30-е сут. в паренхиме селезенки УО соединительной ткани увеличивался, а сосудов, напротив, уменьшался по сравнению с предыдущими сроками и с контрольными животными, что, возможно, связано с «уплотнением рубца». При исследовании паренхимы селезенки после воздействия «неравновесной плазмой» в отдаленные сроки показатели структурной организации белой и красной пульпы, а также соединительной ткани и сосудов не отличались от 30-х суток исследования.

Согласно общей неспецифической адаптационной теории, в ответ на действие различных по качеству раздражителей, к которым можно отнести и воздействие «неравновесной плазмы», развивается «реакция активации», характеризующаяся подъемом активности защитных и регуляторных подсистем организма, и несет основную антистрессовую функцию [1]. Результатом «реакции активации», возможно, и объясняются выявленные нами изменения со стороны малых форм лимфоцитов у экспериметальных животных.

Выводы

1. Для достижения эффективного гемостаза при ранениях и травмах селезенки в эксперименте необходима обработка плазменным потоком кровоточащей поверхности в течение 1,5-2 мин.

2. После гемостаза «неравновесной плазмой» отмечается минимальное повреждение паренхимы селезенки, проявляющееся в первые минуты после воздействия «реакцией активации». В отдалённые сроки паренхима селезенки полностью регенерирует с образованием соединительнотканного рубца, который не нарушает функционирование органа.

Исследование выполнено при финансовой поддержке программы «Приоритет 2012 Фонд содействия Развитию малых форм предприятий в НТС. Проведение НИОКР по государственному контракту № 10848р/19772 от 13.08.2012 г.»

Рис. 1. Селезенка кролика на 3-и сут. после гемостаза «неравновесной плазмой». Нарушение структурной архитектоники паренхимы селезенки. Скопление отечной жидкости в красной пульпе селезенки. Стрелкой указаны расширенные сосуды со сладж-комплексами. Окр. гематоксилином-эозином.

Fig. 1. Spleen of rabbit on 3d day after hemostasis by «nonequilibrium plasma». Defect of structural architectonics of the spleen parenchyma. The accumulation of edema fluid in the red pulp of the spleen. The arrow indicates the expanded vessels with red cell adherence. Hematoxylin-eosin staining.

Рис. 2. Селезенка кролика на 5-е сут. после гемостаза «неравновесной плазмой». Расширение просвета, набухание эндотелиальных клеток и укрупнение ядер гладких миоцитов в центральной вене селезенки (указана стрелкой). Окр. гематоксилином-эозином.

Fig. 2. Spleen of rabbit on 5th day after hemostasis by «nonequilibrium plasma». Dilation, swelling of endothelial cells and enlargement of smooth muscle nuclei in a central vein of the spleen (arrow). Hematoxylin-eosin staining.

Рис. 3. Селезенка кролика на 14-е сут. после гемостаза «неравновесной плазмой». Разрастание соединительной ткани в белой пульпе селезенки с преимущественной локализацией вокруг центральной вены с полным стенозом ее просвета. Окр. пикрофуксином по Ван-Гизону.

Fig. 3. Spleen of rabbit on 14th day after hemostasis by «nonequilibrium plasma». The growth of connective tissue in the white pulp of the spleen around the central vein. Complete stenosis of its lumen. Picro-fuchsin staining.

Рис. 4. Селезенка кролика на 90-е сут. после гемостаза «неравновесной плазмой». Утолщение капсулы селезенки за счет выраженного фиброза. Окр. пикрофуксином по Ван-Гизону.

Fig. 4. Spleen of rabbit on 90th day after hemostasis by «nonequilibrium plasma». Thickening of the capsule of the spleen due to fibrosis. Picro-fuchsin staining.

Таблица 1 / Table 1

Тканевые показатели патологических процессов ткани селезенки после гемостаза неравновесной плазмой

Tissue indicators of pathological processes of spleen tissue after hemostasis by «nonequilibrium plasma»

Рис. 5. Селезенка кролика на 180-е сут после гемостаза «неравновесной плазмой». Белая пульпа селезенки типичного строения. Окр. гематоксилином-эозином.

Fig. 5. Spleen of rabbit on 180th day after hemostasis by «nonequilibrium plasma». The white pulp of the spleen of a typical building. Hematoxylin-eosin staining.

Рис. 6. Отпечаток селезенки кролика на 1-й минуте после гемостаза «неравновесной плазмой». Стрелкой указаны: Пл – плазматическая клетка; С – сегментоядерный нейтрофил; Мл – малый лимфоцит. Ув. 1000. Окр. по Нохту – Максимову.

Fig. 6. Replica of rabbit spleen on 1st min after hemostasis by «nonequilibrium plasma». The arrow indicates: Пл – plasma cell; C – segmented neutrophils; Мл – small lymphocyte. Staining by Nocht - Maximov.

Таблица 2 / Table 2

Спленограмма кроликов после гемостаза неравновесной плазмой

Splenogram of rabbits after hemostasis by «nonequilibrium plasma»

Примечание: ^ - p<0,05 – статистически значимые различия между группами

Note: ^ - p<0,05 – Statistically significant differences between groups.