Simulation of Acute Destructive Pancreatitis with Damage to the Adjacent Adipose Tissue in Pigs

Abstract


The aim of the study was to develop a model of acute destructive pancreatitis with damage to the extra-organ adipose tissue.
Materials and methods. Simulation of acute destructive pancreatitis with damage of the extra-organ adipose tissue was performed in 22 white breed boars aged 3 months. The animals were divided into groups in accordance with two series of studies, where the control (first) group included 15 animals with the pancreas and extra-organ adipose tissue remained intact. Acute destructive pancreatitis was simulated in 7 pigs of the experimental (second) group based on the proposed technique (patent for an invention No. 2668201). Ultrasound examination of the abdominal cavity and retroperitoneal region was applied to confirm the development of expected pathology in experimental animals. Intensity of blood supply was assessed using contrast radiography by injecting a contrast medium into the superior mesenteric artery. Complete blood count and biochemical assay were performed. In addition, during autopsy tissue samples were taken for histological and immunohistochemical investigations to assess changes in the internal organs.
Results. Acute destructive pancreatitis with damage to the extra-organic adipose tissue was regarded as achieved when clinical manifestations of apathy, lethargy, feed refusal were registered in animals. Biochemical blood tests revealed a significant increase in the concentration of alkaline phosphatase and alpha-amylase enzymes. Nitrogenous toxins, in particular, creatinine, were accumulated in the body of the experimental animals. Complete blood count revealed leukocytosis, the fact supporting the onset of the expected inflammatory process in the pancreas and adjacent adipose tissue. The development of necrotic and inflammatory processes in the organ was evidenced by a sharp increase in the level of amylase, creatinine and alkaline phosphatase in the blood of animals. Ultrasound examination revealed a picture of the blurring of pancreatic contours, heterogeneity of the organ structure, increased echogenicity, and enlargement of the duct. Intensification of the vascular pattern and increase in pancreatic contours were detected during the contrast examination of the abdominal vascular system. At autopsy, there were signs of enzymatic peritonitis, namely, serous-hemorrhagic exudate in the abdominal cavity and the cavity of the omental bursa, increased pneumatization of the intestinal tube with a thinning of its wall and foci of small hemorrhages. The pancreatic tissue in all cases was edematous, full-blooded, with multiple foci of fatty necrosis and purulent inflammation. Similar changes were found in the adjacent adipose tissue. At the light-optical level, vascular congestion, small foci of steatonecrosis and micro-abscesses were determined in the pancreas. Immunohistochemical studies largely evidenced the onset of acute destructive pancreatitis with damage to the extra-organ adipose tissue.
Conclusion. Thus, the proposed technique allows simulating acute destructive pancreatitis with damage to the extra-organ adipose tissue in pigs, the event frequently occurring in the clinical practice. In animals the disease is accompanied by clear clinical manifestations correlating with findings of instrumental and laboratory investigations, and autopsy results. Investigations of the pancreatic and extra-organ adipose tissue samples at the light-optical and molecular levels evidence the fact that the authors have simulated a model of acute destructive pancreatitis with involvement of the adipose tissue adjacent to the organ in the pathological process.


Среди патологии хирургического профиля острый деструктивный панкреатит остается одним из самых актуальных заболеваний с тяжелыми последствиями [3, 4, 8], отличающихся частотой гнойно-некротических осложнений [3, 5]. Важно прогнозирование вероятных осложнений при остром деструктивном панкреатите, что требует экспериментальной отработки на крупных лабораторных животных [1, 2, 6, 9]. Известны 3 группы моделирования острого деструктивного панкреатита у свиней [7]. К первой группе относятся каналикулярно-гипертензионные, к 2-й - сосудисто-аллергические, к 3-й - травматические и токсико-инфекционные. Вместе с тем, данным моделям свойственны трудноустранимые недостатки, препятствующие достижению искомых изменений в органе. Гипертензионные модели являются достаточно кропотливыми, зачастую сводящие опыты к формированию геморрагического панкреонекроза. Сосудисто-аллергические способы не всегда способны вызвать деструктивный процесс в поджелудочной железе, так как быстро приводят к склерозу органа. Введение агрессивных растворов в протоковую систему поджелудочной железы часто не приводит к развитию развернутой картины острого панкреатита.
Цель
Целью исследования явилась разработка способа моделирования острого деструктивного панкреатита у свиней. Важно было достичь вовлечения в патологический процесс прилежащей жировой ткани.
Материалы и методы
Воссоздание у свиней модели, сопоставимой с развивающимся у человека острым деструктивным панкреатитом с поражением внеорганной жировой ткани проводилось по предложенной методике (Патент на изобретение № 2668201). Эксперимент проводился на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВО БГАУ, совместно с сотрудниками кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России и были одобрены этическим комитетом БГМУ (№02-2016 от 18.02.2016 г.). При выполнении эксперимента соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» согласно приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. и Хельсинской декларации 1975 г. и ее пересмотренного варианта от 2000 г.
В качестве экспериментальных животных были выбраны поросята хряки белой породы, массой 18-22 кг в возрасте 3 месяцев. Выбор животных был обусловлен анатомическим сходством расположения внутренних органов и кровоснабжения свиньи с человеком, что определило высокую сопоставимость полученных сведений. Животные были подразделены на две группы. В первую группу (контроль) вошли 15 животных. При этом все исследования проводились в условиях интактного состояния поджелудочной железы и окружающих тканей. Вторая группа (7 свиней) была основной, у которых моделировали острый деструктивный панкреатит. Животные содержались в одинаковых условиях, с постоянным доступом к воде. Кормление осуществлялось 3 раза в сутки, а за 12 часов до начала опыта кормление животных прекращалось, за 6 часов – подача воды. За 10-15 минут до введения в наркоз проводилась премедикация путем внутримышечного подведения атропина 0,1% и димедрола в дозе
0,1 мг/кг. Основным наркозом был «Золетил 100», который вводился внутримышечно в дозе 15 мг/кг. В качестве миорелаксанта использовался ксилазин в дозе 4,5 мг/кг. Кроме того, ксилазин доставлялся в организм животных для поддержания анестезии. Для постепенного выведения из медикаментозного сна животным вводился раствор кофеин бензоата натрия 20% - 1 мл. Забор крови из краевой вены уха в пробирки осуществлялся до введения анестетиков и на завершающем этапе эксперимента перед эвтаназией. Затем изучался морфологический состав крови.
Для создания модели острого деструктивного панкреатита была разработана методика, когда использовалась аутожелчь с последующим механическим повреждением поджелудочной железы. Поддержка секреции органа выполнялась за счет добавления в воду 40% раствора этилового спирта. Животные подвергались лапаротомии по белой линии живота, а срединный разрез проводился до пупочной области. Ткани брюшной стенки рассекались послойно по общепринятой методике. Пункционным способом осуществлялся забор желчи в количестве 3 мл из желчного пузыря с последующим наложением на орган кисетного шва. Затем выполнялась мобилизация мягких тканей в проекции поджелудочной железы, а после попадания в полость сальниковой сумки обнажался орган. По введении одноразовым шприцом аутожелчи (3 мл) в различные отделы поджелудочной железы, наносилось повреждение органу за счет сдавления браншами анатомического пинцета. Затем на ткани белой линии живота накладывался непрерывный шов из кетгута, а на кожу - прерывистые узловатые шелковые швы № 3. Животные были угнетены, вялые, отказывались от корма, акт дефекации наблюдался один раз в сутки. Через 72 часа животные выводились из эксперимента. При этом на начальном этапе достигалось наркотическое состояние животных путем введения «золетила 100», затем проводилось внутривенное введение в краевую вену уха 10% раствора лидокаина.
При моделировании острого деструктивного панкреатита проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости и забрюшинной локализации с помощью ветеринарного ультразвукового сканера Ecoson 700W. Рентгенологическое исследование тех же участков осуществлялось с применением контрастного вещества переносным рентгенаппаратом (модель DIG 360), при этом ток рентгеновской трубки составлял 10-16 мА, а режим экспозиции 50-60 мА. До аутопсии изучалась интенсивность кровоснабжения, в том числе поджелудочной железы посредством введения в верхнюю брыжеечную артерию контраста «Урографин» в количестве 2 мл, с добавлением 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида. У секционного стола оценивались изменения внутренних органов и поджелудочной железы. В ходе эксперимента обязательно производился забор биоматериала на гистологическое и иммуногистохимическое исследования. Кусочки ткани толщиной не более 0,5 мм помещались в емкость с 10%-ным водным раствором нейтрального формалина. Затем последовательно биоматериал обезвоживался и заливался в парафин. С помощью роторного микротома изготавливались гистологические срезы толщиной 5-6 мкм и после депарафинизации последние окрашивались гематоксилином и эозином.
С целью иммуногистохимического исследования кусочки ткани поджелудочной железы фиксировались в течение 24 часов в 10% растворе формалина забуференного фосфатами. Дальнейшая проводка и заливка в парафин осуществлялась по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 2 мкм изготавливались на микротоме «Sakura Accu-Cut® SRM™» (Япония) и помещались на стёкла с поли-L-лизиновым покрытием. Гистологические срезы подвергались депарафинизации ксилолом, с последовательной обработкой изопропиловым спиртом, а затем дистиллированной водой. Для оценки апоптоза панкреатоцитов исследовались иммуногистохимические маркеры ключевых точек генетической программы смерти клеток: белки Caspasa-3, p53 и Bcl-2 (коммерческие наборы фирмы Diagnostic BioSystems Inc.). Также была определена пролиферативная активность панкреатоцитов путем иммуногистохимического определения маркера Ki 67 (Коммерческий набор фирмы Spring Bioscience). Демаскировка антигенов, дальнейшее иммунное окрашивание производилось наборами соответствующих фирм-производителей первичных антител с последующей докраской ядер квасцовым гематоксиллином и заключением срезов под покровное стекло. Оценка результатов иммуногистохимического исследования осуществлялась полуколичественным методом на световом микроскопе «Nikon Eclipse E400» при увеличении 400х и видеосистемы «TauVideo» с программой «Тау Морфология» на основе видеокамеры «Watec 221s». При этом анализировались 50 полей зрения в каждом препарате.
Результаты и их обсуждение
Достижение деструктивной формы панкреатита у свиней оценивалось клиническими и морфологическими методами исследования. Ультразвуковое исследование позволило выявить скопление жидкости в полости сальниковой сумки, паренхима поджелудочной железы нередко определялась фрагментами (рис. 1).
Орган имел неоднородную структуру, размытые контуры, причем четко прослеживались расширенные протоки. Паренхима органа была отечной, прилежащая жировая ткань сохраняла признаки эхогенной неоднородности, между петлями кишок определялось небольшое количество свободной жидкости
Контрастное исследование сосудистой системы органов брюшной полости выявило сосудистую сеть средней и нижней трети желудка, а также всей поджелудочной железы. Масса органа достоверно увеличивалась, достигая 34±4,9 г (у контроля масса составляла 20,5±5,3 г). В полости сальниковой сумки определялось скопление мутной жидкости, в поджелудочной железе развивался смешанный панкреонекроз с очагами геморрагий, стеатонекроза и гнойного расплавления. В патологический процесс втягивалась окружающая железу жировая ткань с формированием участков некроза на фоне интерстициального отека органа (рис. 2).
При контрастном рентгенологическим исследовании обнаружено усиление сосудистого рисунка, увеличение контура поджелудочной железы (рис. 3). Подтвержден факт уплотнения близлежащих к поджелудочной железе мягких тканей.
Микроскопическое исследование выявило развитие в ткани поджелудочной железы очагов жирового некроза и гнойного воспаления. Зачастую в прилежащей к органу жировой ткани выявлялись поля геморрагического пропитывания на фоне очагов жирового некроза и нейтрофильной инфильтрации. Гистологическому исследованию подвергались и другие внутренние органы. В печени выявлялось полнокровие центральных вен с очагами кровоизлияний. При этом расширенные портальные тракты представлялись фокусами лимфоцитарной инфильтрации, в гепатоцитах определялись дистрофические изменения. В почках сосуды также были расширены, полнокровные. При этом часть эпителия канальцев находилась в состоянии гидропической дистрофии, часть – с признаками тотального нефроза. Межальвеолярные перегородки в легких были расширены, пронизывались отечной жидкостью на фоне полнокровия сосудов. Нередко в просвете альвеол определялась белковая жидкость. В ряде случаев белковая жидкость с примесью нейтрофилов и клеток слущенного эпителия находились в просвете мелких бронхов и бронхиол. В мелких и мельчайших сосудах сердца, головного мозга, надпочечников регистрировалось их полнокровие и периваскулярный отек.
При иммуногистохимическом исследовании обнаруживались значимые изменения в ткани поджелудочной железы. В контрольной группе животных в ядрах панкреатоцитов определялась выраженная экспрессия Caspasa-3 до 70-90%, однако в строме ядерная экспрессия Caspasa-3 составила от 30-50% (рис. 4а). В группе животных с яркой морфологической картиной панкреонекроза иммуногистохимические исследования выявили выраженную ядерную экспрессию Caspasa-3 в ациноцитах до 75-80%. При этом в строме, стенках сосудов и ветвей панкреатического протока фиксировалась яркая ядерная экспрессия Caspasa-3 до 50% (рис. 4б).
У разных контрольных животных экпрессия Ki 67 в ядрах паренхиматозных и стромальных элементов была равной и составила 10-30% (рис. 5а). В опытной группе в паренхиме органа определялась яркая ядерная экспрессия до 20% Ki67, в строме – умеренная экспрессия до 40% Ki67 (рис. 5б).
В ациноцитах и клетках островков поджелудочной железы в контрольной группе выявлялась яркая очаговая экспрессия bcl-2 до 10%, а также четкая экспрессия bcl-2 до 80% в стенках сосудов, ветвях панкреатического протока и межклеточном веществе (рис.6а).
В опытной группе в ациноцитах яркая ядерная экспрессия bcl-2 определялась лишь в 7-8%, в прилежащей поврежденной жировой ткани и стенках сосудов – яркая ядерная экспрессия bcl-2 до 70% (рис.6б).
В контроле в ациноцитах по всем полям определялась яркая ядерная экспрессия р53 до 90-95%, в эпителии протоков также выражена ядерная экспрессия р53 до 95% (рис.7а). В опытной группе в паренхиме поджелудочной железы обнаружилась яркая ядерная экспрессия р53 до 80%. В строме имела место подобная ядерная экспрессия р53, с преимущественной локализацией положительно окрашенных клеток в стенках протоков поджелудочной железы (рис. 7б).
Перед эвтаназией (третьи сутки опыта), был произведен забор крови из краевой вены уха для общего и биохимического анализа. Результаты приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из таблиц, в опытной и контрольной группах выявлено достоверное различие многих показателей в периферической крови. Представленные в таблице 2 биохимические показатели основной и контрольной групп достоверно различались, что свидетельствует о достижении у лабораторных животных модели острого деструктивного панкреатита.
Заключение
По предложенной методике удается достичь у свиней деструктивной формы панкреатита с поражением прилежащей жировой ткани, что часто наблюдается в клинике. У животных ОДП сопровождался четкими клиническими проявлениями, подтверждающихся результатами аутопсии, данными инструментальных и лабораторных исследований, а также морфологическими методами на светооптическом и молекулярном уровнях исследований. Изменения поджелудочной железы и внеорганной жировой ткани характеризовались глубокими структурными поломками их организации за счет отека, полнокровия сосудов, кровоизлияний, некроза, очагов гнойного расплавления в эпицентре и вдали от него. Предложенная модель ОДП менее трудоемка, достаточно простая в техническом исполнении и может быть методом выбора в условиях решения научно-практических задач.

Imaeva Alfiya

Bashkir State Medical University

Author for correspondence.
Email: galieva_a@mail.ru

Russian Federation, 3, Lenina str., Ufa, 450008, Russian Federation

PhD, associate professor pathological anatomy chair

Tagir Mustafin

Bashkir State Medical University

Email: kaf-pa@bashgmu.ru

Russian Federation, 3, Lenina str,, Ufa, 450008, Russian Federation

DM, professor, head of pathological anatomy chair

Bazekin Georgiy

Bashkir State Agrarian University

Email: george.bazekin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-2785-8499

Russian Federation, 34, 50-letya Oktyabrya Str., Ufa, 450001, Russian Federation

Phd, associate professor, head of morphology, pathology, pharmacy and non-communicable diseases chair

Radmir Rakhimov

Republic Oncologic Clinic

Email: radmir-rr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2488-597X

Russian Federation, 73/1, Prospect Oktyabrya Str., Ufa, 450054, Russian Federation

doctor-oncologist

Ildar Sharifgaliev

Republic Oncologic Clinic

Email: ildarado@bk.ru

Russian Federation, 73/1, Prospect Oktyabrya Str., Ufa, 450054, Russian Federation

doctor-parhologist, head of pathomorphology department

  1. Agapov M.A., V.A. Gorskii, V.A. Petrov, M.D. Polivoda, A.Yu. Kravchenko, A.I. Battaev. Methods of modeling acute pancreatitis (literature review) // Bulletin of RSMU. 2014. №3. Р.25-29 (in Russ.). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/sposoby-modelirovaniya-ostrogo-pankreatita-obzor-literatury (date: 06.11.2019).
  2. Andreeva S.D., Shilov A.V. Structural changes in the lungs in experimental destructive pancreatitis in pigs.// Advances in current natural sciences. 2014. №5(1). P.86-88 (in Russ.). URL: http://www.natural-sciences.ru/ru/article/view?id=33854 (date: 06.11.2019).
  3. Galimov O.V., Sharafutdinov A.N., Ziangirov R.A. etc. Endoscopic techniques in the complex treatment of patients with acute pancreatitis // Pirogov Russian Journal of Surgery. 2002. №9. P.37-40 (in Russ.).
  4. Seliverstov P.A. The clinical significance of pathological changes of retroperitoneal tissue in acute destructive pancreatitis. Diss., Saratov, 2005 (in Russ.).
  5. R.E. Shamsiev, M.A. Nartailakov, M.A. Galeev, T.I. Mustafin. Diagnosis and treatment of septic complications of acute pancreatitis // Proceedings of IX All-Russian congress of surgeons. Volgograd. P.130-131(in Russ.).
  6. Ushkevich A.L., Zhandarov K.N., Prokopchik N.I. Simulation of acute destructive pancreatitis in the experiment. // Novosti Khirurgii. 2010. V.18. №2. P.8-14 (in Russ.).
  7. Shalimov S.A., Radzikhovskii A.P., Keisevich L.V. Experimental surgery guide. Medicine. 1989. P.190-205 (in Russ.).
  8. Lipsett P.A. Serum cytokines, proteins, and receptors in acute pancreatitis: mediators, markers, or more of the same? // Crit. Care. Med. 2001. - Vol. 29, № 8.-P. 1642-1644. doi: 10.1097/00003246-200108000-00029
  9. Pandol S.J., Gukovsky I., Satoh A. Animal and in vitro models of alcoholic pancreatitis: role of cholecystokinin // Pancreas. 2003. - Vol. 27, № 4. - P. 297-300. doi: 10.1097/00006676-200311000-00004

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Views

Abstract - 22

PDF (Russian) - 15

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2020 Alfiya I., Mustafin T., Georgiy B., Rakhimov R., Sharifgaliev I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies