Simulation of Acute Destructive Pancreatitis with Damage to the Adjacent Adipose Tissue in Pigs

Full Text

Среди патологии хирургического профиля острый деструктивный панкреатит остается одним из самых актуальных заболеваний с тяжелыми последствиями [3, 4, 8], отличающихся частотой гнойно-некротических осложнений [3, 5]. Важно прогнозирование вероятных осложнений при остром деструктивном панкреатите, что требует экспериментальной отработки на крупных лабораторных животных [1, 2, 6, 9]. Известны 3 группы моделирования острого деструктивного панкреатита у свиней [7]. К первой группе относятся каналикулярно-гипертензионные, к 2-й - сосудисто-аллергические, к 3-й - травматические и токсико-инфекционные. Вместе с тем, данным моделям свойственны трудноустранимые недостатки, препятствующие достижению искомых изменений в органе. Гипертензионные модели являются достаточно кропотливыми, зачастую сводящие опыты к формированию геморрагического панкреонекроза. Сосудисто-аллергические способы не всегда способны вызвать деструктивный процесс в поджелудочной железе, так как быстро приводят к склерозу органа. Введение агрессивных растворов в протоковую систему поджелудочной железы часто не приводит к развитию развернутой картины острого панкреатита.
Цель
Целью исследования явилась разработка способа моделирования острого деструктивного панкреатита у свиней. Важно было достичь вовлечения в патологический процесс прилежащей жировой ткани.
Материалы и методы
Воссоздание у свиней модели, сопоставимой с развивающимся у человека острым деструктивным панкреатитом с поражением внеорганной жировой ткани проводилось по предложенной методике (Патент на изобретение № 2668201). Эксперимент проводился на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВО БГАУ, совместно с сотрудниками кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России и были одобрены этическим комитетом БГМУ (№02-2016 от 18.02.2016 г.). При выполнении эксперимента соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» согласно приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. и Хельсинской декларации 1975 г. и ее пересмотренного варианта от 2000 г.
В качестве экспериментальных животных были выбраны поросята хряки белой породы, массой 18-22 кг в возрасте 3 месяцев. Выбор животных был обусловлен анатомическим сходством расположения внутренних органов и кровоснабжения свиньи с человеком, что определило высокую сопоставимость полученных сведений. Животные были подразделены на две группы. В первую группу (контроль) вошли 15 животных. При этом все исследования проводились в условиях интактного состояния поджелудочной железы и окружающих тканей. Вторая группа (7 свиней) была основной, у которых моделировали острый деструктивный панкреатит. Животные содержались в одинаковых условиях, с постоянным доступом к воде. Кормление осуществлялось 3 раза в сутки, а за 12 часов до начала опыта кормление животных прекращалось, за 6 часов – подача воды. За 10-15 минут до введения в наркоз проводилась премедикация путем внутримышечного подведения атропина 0,1% и димедрола в дозе
0,1 мг/кг. Основным наркозом был «Золетил 100», который вводился внутримышечно в дозе 15 мг/кг. В качестве миорелаксанта использовался ксилазин в дозе 4,5 мг/кг. Кроме того, ксилазин доставлялся в организм животных для поддержания анестезии. Для постепенного выведения из медикаментозного сна животным вводился раствор кофеин бензоата натрия 20% - 1 мл. Забор крови из краевой вены уха в пробирки осуществлялся до введения анестетиков и на завершающем этапе эксперимента перед эвтаназией. Затем изучался морфологический состав крови.
Для создания модели острого деструктивного панкреатита была разработана методика, когда использовалась аутожелчь с последующим механическим повреждением поджелудочной железы. Поддержка секреции органа выполнялась за счет добавления в воду 40% раствора этилового спирта. Животные подвергались лапаротомии по белой линии живота, а срединный разрез проводился до пупочной области. Ткани брюшной стенки рассекались послойно по общепринятой методике. Пункционным способом осуществлялся забор желчи в количестве 3 мл из желчного пузыря с последующим наложением на орган кисетного шва. Затем выполнялась мобилизация мягких тканей в проекции поджелудочной железы, а после попадания в полость сальниковой сумки обнажался орган. По введении одноразовым шприцом аутожелчи (3 мл) в различные отделы поджелудочной железы, наносилось повреждение органу за счет сдавления браншами анатомического пинцета. Затем на ткани белой линии живота накладывался непрерывный шов из кетгута, а на кожу - прерывистые узловатые шелковые швы № 3. Животные были угнетены, вялые, отказывались от корма, акт дефекации наблюдался один раз в сутки. Через 72 часа животные выводились из эксперимента. При этом на начальном этапе достигалось наркотическое состояние животных путем введения «золетила 100», затем проводилось внутривенное введение в краевую вену уха 10% раствора лидокаина.
При моделировании острого деструктивного панкреатита проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости и забрюшинной локализации с помощью ветеринарного ультразвукового сканера Ecoson 700W. Рентгенологическое исследование тех же участков осуществлялось с применением контрастного вещества переносным рентгенаппаратом (модель DIG 360), при этом ток рентгеновской трубки составлял 10-16 мА, а режим экспозиции 50-60 мА. До аутопсии изучалась интенсивность кровоснабжения, в том числе поджелудочной железы посредством введения в верхнюю брыжеечную артерию контраста «Урографин» в количестве 2 мл, с добавлением 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида. У секционного стола оценивались изменения внутренних органов и поджелудочной железы. В ходе эксперимента обязательно производился забор биоматериала на гистологическое и иммуногистохимическое исследования. Кусочки ткани толщиной не более 0,5 мм помещались в емкость с 10%-ным водным раствором нейтрального формалина. Затем последовательно биоматериал обезвоживался и заливался в парафин. С помощью роторного микротома изготавливались гистологические срезы толщиной 5-6 мкм и после депарафинизации последние окрашивались гематоксилином и эозином.
С целью иммуногистохимического исследования кусочки ткани поджелудочной железы фиксировались в течение 24 часов в 10% растворе формалина забуференного фосфатами. Дальнейшая проводка и заливка в парафин осуществлялась по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 2 мкм изготавливались на микротоме «Sakura Accu-Cut® SRM™» (Япония) и помещались на стёкла с поли-L-лизиновым покрытием. Гистологические срезы подвергались депарафинизации ксилолом, с последовательной обработкой изопропиловым спиртом, а затем дистиллированной водой. Для оценки апоптоза панкреатоцитов исследовались иммуногистохимические маркеры ключевых точек генетической программы смерти клеток: белки Caspasa-3, p53 и Bcl-2 (коммерческие наборы фирмы Diagnostic BioSystems Inc.). Также была определена пролиферативная активность панкреатоцитов путем иммуногистохимического определения маркера Ki 67 (Коммерческий набор фирмы Spring Bioscience). Демаскировка антигенов, дальнейшее иммунное окрашивание производилось наборами соответствующих фирм-производителей первичных антител с последующей докраской ядер квасцовым гематоксиллином и заключением срезов под покровное стекло. Оценка результатов иммуногистохимического исследования осуществлялась полуколичественным методом на световом микроскопе «Nikon Eclipse E400» при увеличении 400х и видеосистемы «TauVideo» с программой «Тау Морфология» на основе видеокамеры «Watec 221s». При этом анализировались 50 полей зрения в каждом препарате.
Результаты и их обсуждение
Достижение деструктивной формы панкреатита у свиней оценивалось клиническими и морфологическими методами исследования. Ультразвуковое исследование позволило выявить скопление жидкости в полости сальниковой сумки, паренхима поджелудочной железы нередко определялась фрагментами (рис. 1).
Орган имел неоднородную структуру, размытые контуры, причем четко прослеживались расширенные протоки. Паренхима органа была отечной, прилежащая жировая ткань сохраняла признаки эхогенной неоднородности, между петлями кишок определялось небольшое количество свободной жидкости
Контрастное исследование сосудистой системы органов брюшной полости выявило сосудистую сеть средней и нижней трети желудка, а также всей поджелудочной железы. Масса органа достоверно увеличивалась, достигая 34±4,9 г (у контроля масса составляла 20,5±5,3 г). В полости сальниковой сумки определялось скопление мутной жидкости, в поджелудочной железе развивался смешанный панкреонекроз с очагами геморрагий, стеатонекроза и гнойного расплавления. В патологический процесс втягивалась окружающая железу жировая ткань с формированием участков некроза на фоне интерстициального отека органа (рис. 2).
При контрастном рентгенологическим исследовании обнаружено усиление сосудистого рисунка, увеличение контура поджелудочной железы (рис. 3). Подтвержден факт уплотнения близлежащих к поджелудочной железе мягких тканей.
Микроскопическое исследование выявило развитие в ткани поджелудочной железы очагов жирового некроза и гнойного воспаления. Зачастую в прилежащей к органу жировой ткани выявлялись поля геморрагического пропитывания на фоне очагов жирового некроза и нейтрофильной инфильтрации. Гистологическому исследованию подвергались и другие внутренние органы. В печени выявлялось полнокровие центральных вен с очагами кровоизлияний. При этом расширенные портальные тракты представлялись фокусами лимфоцитарной инфильтрации, в гепатоцитах определялись дистрофические изменения. В почках сосуды также были расширены, полнокровные. При этом часть эпителия канальцев находилась в состоянии гидропической дистрофии, часть – с признаками тотального нефроза. Межальвеолярные перегородки в легких были расширены, пронизывались отечной жидкостью на фоне полнокровия сосудов. Нередко в просвете альвеол определялась белковая жидкость. В ряде случаев белковая жидкость с примесью нейтрофилов и клеток слущенного эпителия находились в просвете мелких бронхов и бронхиол. В мелких и мельчайших сосудах сердца, головного мозга, надпочечников регистрировалось их полнокровие и периваскулярный отек.
При иммуногистохимическом исследовании обнаруживались значимые изменения в ткани поджелудочной железы. В контрольной группе животных в ядрах панкреатоцитов определялась выраженная экспрессия Caspasa-3 до 70-90%, однако в строме ядерная экспрессия Caspasa-3 составила от 30-50% (рис. 4а). В группе животных с яркой морфологической картиной панкреонекроза иммуногистохимические исследования выявили выраженную ядерную экспрессию Caspasa-3 в ациноцитах до 75-80%. При этом в строме, стенках сосудов и ветвей панкреатического протока фиксировалась яркая ядерная экспрессия Caspasa-3 до 50% (рис. 4б).
У разных контрольных животных экпрессия Ki 67 в ядрах паренхиматозных и стромальных элементов была равной и составила 10-30% (рис. 5а). В опытной группе в паренхиме органа определялась яркая ядерная экспрессия до 20% Ki67, в строме – умеренная экспрессия до 40% Ki67 (рис. 5б).
В ациноцитах и клетках островков поджелудочной железы в контрольной группе выявлялась яркая очаговая экспрессия bcl-2 до 10%, а также четкая экспрессия bcl-2 до 80% в стенках сосудов, ветвях панкреатического протока и межклеточном веществе (рис.6а).
В опытной группе в ациноцитах яркая ядерная экспрессия bcl-2 определялась лишь в 7-8%, в прилежащей поврежденной жировой ткани и стенках сосудов – яркая ядерная экспрессия bcl-2 до 70% (рис.6б).
В контроле в ациноцитах по всем полям определялась яркая ядерная экспрессия р53 до 90-95%, в эпителии протоков также выражена ядерная экспрессия р53 до 95% (рис.7а). В опытной группе в паренхиме поджелудочной железы обнаружилась яркая ядерная экспрессия р53 до 80%. В строме имела место подобная ядерная экспрессия р53, с преимущественной локализацией положительно окрашенных клеток в стенках протоков поджелудочной железы (рис. 7б).
Перед эвтаназией (третьи сутки опыта), был произведен забор крови из краевой вены уха для общего и биохимического анализа. Результаты приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из таблиц, в опытной и контрольной группах выявлено достоверное различие многих показателей в периферической крови. Представленные в таблице 2 биохимические показатели основной и контрольной групп достоверно различались, что свидетельствует о достижении у лабораторных животных модели острого деструктивного панкреатита.
Заключение
По предложенной методике удается достичь у свиней деструктивной формы панкреатита с поражением прилежащей жировой ткани, что часто наблюдается в клинике. У животных ОДП сопровождался четкими клиническими проявлениями, подтверждающихся результатами аутопсии, данными инструментальных и лабораторных исследований, а также морфологическими методами на светооптическом и молекулярном уровнях исследований. Изменения поджелудочной железы и внеорганной жировой ткани характеризовались глубокими структурными поломками их организации за счет отека, полнокровия сосудов, кровоизлияний, некроза, очагов гнойного расплавления в эпицентре и вдали от него. Предложенная модель ОДП менее трудоемка, достаточно простая в техническом исполнении и может быть методом выбора в условиях решения научно-практических задач.

About the authors

Imaeva K Alfiya

Bashkir State Medical University

Author for correspondence.
Email: galieva_a@mail.ru

PhD, associate professor pathological anatomy chair

Russian Federation, 3, Lenina str., Ufa, 450008, Russian Federation

Tagir I Mustafin

Bashkir State Medical University

Email: kaf-pa@bashgmu.ru

DM, professor, head of pathological anatomy chair

Russian Federation, 3, Lenina str,, Ufa, 450008, Russian Federation

Bazekin V Georgiy

Bashkir State Agrarian University

Email: george.bazekin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-2785-8499

Phd, associate professor, head of morphology, pathology, pharmacy and non-communicable diseases chair

Russian Federation, 34, 50-letya Oktyabrya Str., Ufa, 450001, Russian Federation

Radmir R Rakhimov

Republic Oncologic Clinic

Email: radmir-rr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2488-597X

doctor-oncologist

Russian Federation, 73/1, Prospect Oktyabrya Str., Ufa, 450054, Russian Federation

Ildar A Sharifgaliev

Republic Oncologic Clinic

Email: ildarado@bk.ru

doctor-parhologist, head of pathomorphology department

Russian Federation, 73/1, Prospect Oktyabrya Str., Ufa, 450054, Russian Federation

References

Supplementary files