The Algorithm For Obtaining Referential Meanings Of Biochemical And Complete Blood Tests Coagulogram In Wistar Male Rats At Blood Sampling From Carotid Artery

Full Text

В современной литературе, особенно отечественной, не так много публикаций, детально освещающих работу с экспериментальными животными по принципу «how to do it», после прочтения которых у исследователя не возникнет существенных вопросов при попытке воспроизвести предложенную методику самому. Это имеет отношение и к забору крови с целью оценки определенных показателей у мелких лабораторных животных, в частности, лабораторных крыс линии Wistar. На сегодняшний день предложено несколько возможных доступов для забора крови и определения показателей коагулограммы, общего и биохимического анализа крови у лабораторной крысы: вентральная хвостовая вена, дорсальная артерия хвоста, задняя вена стопы, подкожная вена голени, мандибулярная вена и артерия, яремная вена, ретроорбитальный синус, полая вена, бедренная артерия и вена, аорта, сердце и сонная артерия [8, 9].
Естественно, что при использовании того или иного доступа результаты полученных анализов могут отличаться в силу различных метаболических, анатомических и физических факторов [10], кроме того у каждого доступа есть свои ограничения по возможному реальному объему, времени забора крови и технические особенности при выполнении [9]. При работе с экспериментальным животным небольшой массы тела актуальным остается возможность забрать образец крови быстро, в необходимом объеме и из одного простого доступа с возможностью выполнения повторных измерений. В полной мере этим требованиям отвечает канюлирование сонной артерии под анестезией золазепамом/тилетамином + ксилазином, которое делает возможным получить образцы крови объемом до 10-12 мл у крыс массой 270-380 г в течение 1-2 мин для оценки коагулограммы, биохимического и общего анализа. Это позволяет изучать различные патологические состояния и объективно сравнивать контрольную и экспериментальную группы.
Цель исследования. Разработать доступ и методику катетеризации сонной артерии для получения образцов крови и определения референсных значений коагулограммы, общего и биохимического анализа крови у крыс-самцов линии Wistar, уточнив полученные значения бутстреп-методом и сравнив их с ранее опубликованными данными.
Материалы и методы
Эксперименты проведены на крысах-самцах (n=42) линии Wistar массой 270-380 г, наркотизированных тилетамин/золазепамом (40 мг/кг внутримышечно) + ксилазином (10 мг/кг внутримышечно). Глубину наркоза оценивали по отсутствию глотательного и ресничного рефлекса, а также отсутствию реакции на боль при сжимании запястья или пальца на лапке. Кровь для анализа забирали из левой сонной артерии, доступ к которой осуществлен с учетом анатомических особенностей животного. Забор крови для анализа осуществляли за 1 мин в следующем порядке и объеме: 200 мкл в микроветту с ЭДТА шприцем 1 мл для общего анализа крови, 500 мкл шприцем 1 мл с 18 МЕ/мл гепарина-натрия для оценки глюкозы и лактата, 4,5 мл шприцем 6 мл с 0,5 мл 3,8% цитратом для оценки параметров коагулограммы, 5 мл шприцем 6 мл без цитрата для оценки биохимического анализа крови. Анализ выполняли в течение 1 часа.
Показатели общего анализа крови, такие как количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина и показатель гематокрита, оценивали на автоматическом гематологическом анализаторе ABX Micros ES 60, показатели биохимического анализа крови, такие как сывороточный уровень общего билирубина, активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), уровень креатинина, мочевины и общего белка,  – на автоматическом биохимическом анализаторе Cobas Integra 400 plus, содержание глюкозы и лактата – на автоматическом анализаторе глюкозы и лактата Super GL Ambulance, уровень фибриногена – на полуавтоматическом коагулометре Thrombotimer 4 Behnk Elektronik, показатели активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ), тромбинового времени (ТВ) и антитромбина III (хромогенный метод) - на автоматическом анализаторе коагуляции крови Sysmex CA‑600,   плазминогена  (хромогенный метод)  на  полуавтоматическом  фотометре Riele 5010 v5+ с использованием длины волны, равной 405 нм. Для определения показателей коагулограммы использовали реактивы ООО фирмы «Технология-Стандарт». Из эксперимента животное выводилось за счет забора максимально возможного объема циркулирующей крови через катетер в левой сонной артерии и как следствие остановки дыхания и сердечной деятельности при поддержании глубины общей анестезии.
Статистическая обработка полученных результатов была проведена при помощи языка программирования R с использованием статистических пакетов “boot”, “car” , “sm”, “coin”, “VIM” и “mice” [3, 4, 7]. Выбросы исключены методом Тьюки на основе интервала «нормальных» значений: [Q1–1,5·IQR, Q3+1,5·IQR], где Q1, Q3 — границы первого и третьего квартилей, IQR=Q3–Q1 — межквартильный размах. Пробелы показателей были заполнены с помощью многомерного восстановления данных связанными уравнениями (multivariate imputation by chained equations) пакетами “VIM” и “mice”. Нормальность распределения оценивалась по критерию Шапиро-Уилка, а также перепроверялась графически с использованием квантильных графиков методом огибающих Б. Рипли (simulation envelopes) и кривых ядерной плотности, реализованных соответственно в пакетах “car” , “sm”. Для всех показателей определены были медиана (Me), среднее (М), первый и третий квартиль (Q1, Q3) и среднеквадратичное отклонение (SD). Референсные значения представлены в виде M±1,96SD,  дополнительно для показателей с ненормальным распределением по критерию Шапиро-Уилка границы нормы определены в рамках 2,5 и 97,5‰. Референсные значения всех показателей были уточнены методом бутстрепа с коррекцией смещения  и  ускорением  (ВСа)  на  основании  5000  псевдовыборок. Рассчитаны  среднее,  медиана,  стандартное  среднеквадратичное  отклонение   бутстреп‑выборки  и  их  95%   доверительные   интервалы  (95 CI %).  Для   расчета  референсных  границ  использовали  среднее  и   стандартное  квадратичное  отклонение бутстреп‑выборки.  Сравнение  между группами  выполнено пермутационным тестом с 10000 итераций из пакета “coin” для двух выборок с коррекцией уровня p на множественные сравнения методом  Беньямини-Йекутили. Уровень α принят, равный 0,05.
Результаты и их обсуждение
Доступ к сонной артерии осуществляли с учетом анатомии животного в следующем порядке. Ножницами рассекалась кожа и подкожная жировая клетчатка по средней линии от уровня углов нижней челюсти до грудины рис. 1-4. Поднижнечелюстные слюнные железы тупым способом отводились в разные стороны, а кивательная мышца - кнаружи рис. 5-8. После рассечения лопаточно-подъязычной мышцы с левой стороны обнажался главный сосудисто-нервный пучок шеи, который выводился из глубины раны на офтальмологическом пинцете рис. 9-12. Далее тупым способом производилась отсепаровка блуждающего нерва от сонной артерии во избежание его повреждения при перевязке сосуда. После выделения в ране визуализировался отрезок левой сонной артерии около 1,5 см рис. 13-16. Под центральный конец выделенного участка сонной артерии подводили две, а под периферический - одну, капроновые или викриловые лигатуры 3-0, которыми в дальнейшем выполнялась перевязка сосуда. В верхнем углу раны на кожу накладывали один узловой шов 3-0 полипропиленовой или викриловой лигатурой, свободные концы нити в последующем использовали для фиксации катетера рис. 17-19. Периферический конец выделенного участка сонной артерии перевязывали ранее подведенной нитью, а нити под приводящим концом натягивали, одновременно приподнимая подведенный под сосуд пинцет, за счет чего происходило ограничение кровотока по артерии [2]. Шприц объемом 1 мл с иглой 27-29 G, обращенной срезом книзу, располагали параллельно сонной артерии у головного конца выделенного отрезка сосуда рис. 20. Прижимая иглу к передней стенке артерии и продвигая ее каудально, осуществляли бескровный доступ в сосуд, после чего игла извлекалась из просвета. Через выполненное отверстие по проводнику осуществляли введение катетера 24G из фторэтиленпропилена, пинцет опускали, натяжение лигатур под приводящим концом ослабляли и, натягивая за нить на отводящем конце сосуда, выполняли установку катетера в сонную артерию. Лигатуры на приводящем конце сосуда перевязывали, катетер фиксировался к коже рис. 21-22. Через 20 минут после установки катетера, когда нивелировалось влияние выделения блуждающего нерва и сонной артерии на системную гемодинамику, осуществляли забор крови. Гепарин или другой антикоагулянт для промывания катетера не использовался. Забор крови выполняли после механического очищения катетера введением 300 мкл 0,9% раствора натрия хлорида с последующим немедленным обратным удалением 600 мкл крови. Образцы крови подвергались соответствующему исследованию. В табл. 1 представлены результаты анализа крови 42 крыс [1]. Для показателей глюкозы, АлАТ, АсАТ, мочевины, протромбинового времени и фибриногена, у которых значение критерия Шапиро-Уилка p<0,05, был рассчитан 2,5 и 97,5 ‰  интервал. При графической оценке квантильных графиков методом огибающих Б. Рипли (simulation envelopes) и кривых ядерной плотности перечисленных показателей, несмотря на значения критерий Шапиро-Уилка, указывающие на ненормальное распределение, выявлен нормальный характер распределения рис.23-24. Косвенно данное предположение было подтверждено после уточнения референсных границ и Ме, М, SD методом бутстрепа с генерацией 5000 псевдовыборок, небольшими различиями перечисленных выше статистик в эмпирической и бутстреп-выборке. По этой причине приемлемо считать референсными границы для них в рамках М±1,96SD.  Уточненные  методом  бутстрепа  с  коррекцией  смещения  и  ускорением  (ВСа)  статистики  с  95%  доверительными интервалами представлены  в табл. 2. Средний вес крыс составил около 350 г, что соответствует возрасту около 8-9 недель [5, 11]. Для сравнения были взяты данные Clifford C.B. и Giknis M.L.A., 180 крыс-самцов линии Wistar 8-16 недель, у которых кровь для анализа забирали из брюшной аорты [6]. Показатели лактата, антитромбина III, плазминогена и тромбинового времени не сравнивались ввиду отсутствия данных. Как видно из табл. 3, статистически значимые различия были получены по всем показателям, кроме количества лейкоцитов, тромбоцитов, уровня гематокрита и общего билирубина. Полученные результаты можно объяснить разными климатическими условиями, анестезиологическим пособием, доступом для забора крови и большим разбросом возраста у сравниваемых крыс. Клинически различия незначимы.
Заключение
Таким образом, разработанный алгоритм получения образцов крови и референсных значений показателей коагулограммы, общего и биохимического анализа крови у крыс-самцов линии Wistar при заборе из сонной артерии следует считать рациональным. Полученные референсные значения могут быть использованы для изучения различных патологических состояний в экспериментальной медицине.

About the authors

A A Kinzerskiy

Omsk State Medical University of the Russian Federation  Ministry of Health

Author for correspondence.
Email: kinzerskij@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5749-1873
SPIN-code: 9880-4945
http://omsk-osma.ru/

postgraduate student of Department  of the General surgery

Russian Federation, 12, Lenin Str., Omsk, 644099

M S Korzhuk

Omsk State Medical University of the Russian Federation  Ministry of Health

Email: kinzerskij@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4579-2027
SPIN-code: 1031-6315

MD, Head of Department  of the General surgery

Russian Federation, 12, Lenin Str., Omsk, 644099

V T Dolgich

Omsk State Medical University of the Russian Federation  Ministry of Health

Email: kinzerskij@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9034-4912
SPIN-code: 2052-1445

MD, Honoured Scientist of the Russian Federation, Head of Department of the Pathophysiology including Clinical Pathophysiology Course of Omsk State Medical University

Russian Federation, 12, Lenin Str., Omsk, 644099

References

Supplementary files