The effectiveness of the reparative processes stimulation of the platelet-rich plasma in case of the abdominal wall endoprosthetics

Full Text

В Российской герниологии за последние 20 лет произошли революционные изменения вследствие внедрения в технологию лечения вентральных грыж эндопротезирования брюшной стенки. Если при применении аутопластических методов закрытия дефектов брюшной стенки рецидив заболевания развивался у 20-30% больных, то после эндопротезирования стандартными полипропиленовыми сетками с диаметром нити 120 микрон слабых мест, количество рецидивов снизилось до 3-5% [1, 2]. Однако, стандартные эндопротезы имеют большую материалоемкость. Поэтому после имплантации в брюшную стенку развивается гиперпластическая реакция соединительнотканных элементов капсулы, которая ограничивает подвижность брюшной стенки, вызывает развитие хронического болевого синдрома в области послеоперационного рубца, ощущения у больных инородного тела [3, 4]. Снижение качества жизни пациентов привело к внедрению в клиническую практику легких, с диаметром нити 90 микрон, и суперлегких с диаметром нити 70 микрон, эндопротезов [5]. К сожалению, при применении легких материалов количество рецидивов вентральных грыж возросло до 8-10% вследствие их низкой прочности и гипопластической реакции соединительной ткани брюшной стенки в местах их имплантации [6, 7]. Плохо сформированная соединительно-тканная капсула приводила к образованию складок и появлению рецидива заболевания по краю эндопротеза [8, 9]. Для стимуляции замедленной регенерации тканей стали применяться аллогенные эмбриональные фибробласты. Установлено, что при их двукратном введении в операционную рану с имплантированным протезом, происходит ускорение купирования воспалительной реакции и быстрое завершение дифференцировки соединительной ткани [10]. К сожалению, данный метод не вошел в клиническую практику из-за необходимости специализированной лаборатории для изготовления аллогенных эмбриональных фибробластов и недостатка материалов для их производства. В последние годы с целью стимуляции репаративных процессов при аллогерниопластике стали применяться фармакологические лекарственные препараты: аскорбиновую кислоту, оротат калия и солкосерил [11, 12, 13]. Наибольшей эффективностью в стимуляции неоколлагеногенеза обладает солкосерил, оказывающий позитивное влияние на репаративные процессы путем улучшения транспорта кислорода и глюкозы клеткам, находящимся в состоянии гипоксии. Однако данные препараты не входят в стандарты лечения вентральных грыж и не оплачиваются фондами медицинского страхования, что создает определенные трудности для их применения в лечении больных. Кроме этого, лекарственные препараты оказывали в большей степени позитивное системное воздействие и в меньшей степени на процессы регенерации в области аллогерниопластики.
Хорошо известно, что эффективным средством стимуляции репаративных процессов является введение в ткани аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами. Альфа-гранулы плазмы содержат факторы роста – естественные полипептиды, обладающие широким спектром биологического локального воздействия на основные звенья репаративного процесса: хемотаксис, клеточную пролиферацию, миграцию клеток, дифференцировку, реструктуризацию и ангиогенез [14]. Изучение влияния плазмы, обогащенной тромбоцитами на течение раневого процесса при имплантации синтетического протеза в брюшную стенку до настоящего времени не произведено.
Цель исследования - изучить морфологические изменения соединительной ткани, окружающей легкий полипропиленовый эндопротез, на ранних сроках имплантации, при использовании обогащенной тромбоцитами аутоплазмы.
Материалы и методы
Экспериментальное исследование проведено в центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России. Эксперименты выполнены на 50 кроликах порода «Шиншилла», одного пола (самцы), массой 2500 г, в возрасте от 1 по 1,5 лет. Выбор кроликов в качестве экспериментальных животных был обусловлен возможностью экстраполяции данных о реактивных изменениях тканей, окружающих эндопротез в условиях использования плазмы, обогащенной тромбоцитами, на ткани человека.
Животных отбирали в эксперимент без внешних признаков заболевания после двухнедельного карантина в условиях вивария Курского государственного медицинского университета.
Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP) и соответствовали международным рекомендациям (этическому кодексу) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985 г.), с соблюдением принципов, изложенных в законе «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 104679 – ГД от 01.12.1999 г., и согласно приказу Минздрава России от 19.06.2003г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики».
Материалом для исследования был выбран легкий полипропиленовый сетчатый эндопротез с диаметром нити 90 микрон.
Экспериментальные животные были разделены на две группы по 25 животных в каждой. Животным 1-й группы надапоневротически имплатировали легкий эндопротез без введения в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы, во 2-й группе имплантировали аналогичный протез с введением в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы.
Все эксперименты были выполнены с соблюдением правил асептики и антисептики. Животным в 1 группе под общим наркозом (внутривенно вводили препарат «Золетил 50» в дозе 5 мг/кг массы) в асептических условиях выполняли срединный разрез кожи, подкожной клетчатки длиной 7 см по белой линии живота отступив от мечевидного отростка 1-2 см в направлении к лобковому симфизу. Тупым и острым путем освобождали апоневроз прямых мышц живота от подкожной жировой клетчатки на 2 см в каждую сторону от срединного разреза. На апоневроз укладывали сетчатый полипропиленовый эндопротез размерами 3 х 2 см. Фиксацию эндопротеза выполняли непрерывным швом полипропиленовой мононитью 3/0. Гемостаз проводили по ходу операции. После завершения оперативного вмешательства, отдельными узловыми швами ушивали подкожную жировую клетчатку и кожу. Рану не дренировали.
Животным во 2-й группе перед операцией готовили аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, по следующей методике. После удаления шерсти и обработки 70% раствором этилового спирта, из вены уха кролика аспирировали в стерильную вакуумную пробирку с 3,8% цитратом натрия (1:9) 5 мл крови. Производили однократное центрифугирование при 1500 оборотах в минуту в течение 15 минут. Шприцем с длинной иглой производили забор осадка в объеме 2,5-х мл обогащенной тромбоцитами плазмы, с количеством тромбоцитов более 1 млн. в 1 мл. В нее добавляли 10% раствор хлорида кальция для активации тромбоцитов в объеме 0,1 мл. Аналогичным образом как у животных первой группы надапоневротически имплантировали легкий протез. После имплантации в ткани передней брюшной стенки вводили в области 4 углов и по центру под сетчатый эндопротез аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, в объеме 0,5 мл плазмы на 1 см2 сетчатого эндопротеза. Гемостаз проводили по ходу операции. По окончанию оперативного вмешательства отдельными узловыми швами ушивали кожу и подкожную клетчатку. На 3 сутки после операции у кролика повторно выполняли забор крови из вены уха, по изложенной выше методике получали обогащенную тромбоцитами аутоплазму и повторно вводили ее в ткани передней брюшной стенки под имплантированный сетчатый эндопротез в области 4 углов и по центру, в объеме 0, 5 мл плазмы на 1 см2 сетчатого эндопротеза. Обогащенную тромбоцитами плазму вводили в места, где наиболее часто возникает разрыв и отторжение трансплантата. Повторное введение обогащенной тромбоцитами аутоплазмы способствует быстрому протеканию стадии экссудации и наступлению стадии пролиферации раневого процесса, а так же дальнейшей стимуляции репаративных процессов [14].
На протяжении всего эксперимента проводили динамическое наблюдение за общим состоянием животных и заживлением послеоперационных ран. Из эксперимента животных выводили на 3, 7, 10, 14 и 21 сутки после операции, путем передозировки средств для наркоза.
После выведения животных из эксперимента в указанные сроки проводили забор материала для морфологических исследований.
Для гистологического изучения реактивных изменений тканей, окружающих имплантированный эндопротез, иссекали единым блоком участок передней брюшной стенки кролика размерами 2х2 см, включая материал эндопротеза. Извлеченные фрагменты биологического материала растягивали на платинах плотного картона для предупреждения их деформации во время фиксации, а затем полностью погружали в 10% раствор забуференного нейтрального формалина на 2 недели с обязательной заменой раствора на 2-е сутки фиксации. После фиксации, из взятого блока иссекали кусочки размерами 1 х 1 см, включающие материал эндопротеза и заливали в парафин по стандартной методике. Далее изготовляли гистологические срезы толщиной 5-7 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (с целью обзорного изучения), по Маллори и по методу ван Гизона (для изучения реактивных изменений окружающей соединительной ткани).
Микроскопирование и микрофотосъемку осуществляли с помощью оптической системы, состоящей из светового микроскопа Leica CME, цифровой окуляр-камеры DCM - 510 на увеличениях х40, х100, х 200 и х400 крат с документированием снимков в программе FUTURE WINJOE, входящей в комплект поставки окуляр - камеры.
На микрофотографиях выполняли оценку площади воспалительно-клеточного инфильтрата вокруг нитей эндопротезов, строение соединительнотканной капсулы, наличие и выраженность ее слоев, степень зрелости коллагеновых волокон и их толщину.
Морфометрию осуществляли следующим образом: все полученные гистологические препараты были сфотографированы при увеличении х200 и х400.
При микроскопии на малом увеличении оценивали наличие и строение соединительнотканной капсулы, выраженность ее слоев, степень взаимной интеграции волокон капсулы и окружающих соединительнотканных структур (апоневроз и фасции мышц передней брюшной стенки). При микроскопии на большом увеличении (х400), оценивали клеточный и волокнистый компонент, окружающий эндопротез соединительной ткани. По кариологическим признакам дифференцировали: фибробласты и фиброциты, макрофаги, плазматические клетки, лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и тучные клетки. Процентное соотношение указанных представителей клеточной популяции рассчитывали после подсчета 100 клеток в нескольких непересекающихся полях зрения.
Для объективизации формирования заключения о морфологических изменениях вокруг нитей протеза мы использовали метод подсчета клеточного индекса (КИ) по следующей формуле:
КИ =
Клетки резиденты – общее количество макрофагов, фибробластов и фиброцитов. Клетки нерезиденты – общее количество гранулоцитов (все три вида), моноцитов, лимфоцитов, тучных клеток и плазмоцитов, рекрутированных в очаг воспаления. При значении клеточного индекса <1 делали вывод о преобладании воспалительных изменений, характерных для I фазы течения раневого процесса, при значении >1 делали вывод о преобладании репаративных тенденций, характерных для II фазы.
Статистика
Выбор методов статистического анализа проводили в соответствии с ГОСТ Р 50779.11-2000 (ИСО 3534-2-93). Полученные цифровые данные обрабатывали статистически с целью изучения статистической значимости расхождений средних величин в сравниваемых группах. После определения типа распределения данных был выбран метод оценки достоверности отличий по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Учитывая низкую чувствительность непараметрических методик к типу распределения, а также допустимый для экспериментальных медико-биологических исследований уровень p≤0,05, для подтверждения статистической гипотезы был выбран именно такой уровень значимости. Все вычисления выполнялись с помощью аналитического пакета приложения Excel Office 2010, лицензией на право использования которой обладает ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России.
Результаты и их обсуждение
Результаты морфометрического исследования клеточного состава окружающих эндопротез тканей и клеточного индекса на разных сроках эксперимента представлены в таблице 1.
У животных второй группы после введения аутоплазмы воспалительная реакция по динамике нейтрофилов на имплантированный протез была на 3-и сутки эксперимента ниже в 1,3, на 7-е в 1,2, на 10-е в 1,1 раза, чем у животных в первой группе. На последующих сутках она была слабо выражена в обеих группах. Фибробластическая реакция наоборот после введения аутоплазмы увеличивалась на 3-и сутки в 1,2, на 7-е сутки в 1,14, на 14-е сутки в 1,18 раза. В обеих группах на протяжении всего эксперимента динамика макрофагов была одинакова. Статистически достоверные отличия были выявлены на 14 сутки эксперимента между клетками макрофагального ряда, так в контрольной группе количество макрофагов снизилось в 1,3 раза, а в опытной – в 1,6 раза по сравнению с 3 сутками.
Рассматривая изменения клеточного индекса, как изменение клеточного состава окружающих эндопротез нитей, в обеих группа отмечали его увеличение. Уже к 7 суткам значение клеточного индекса превышало 1, что свидетельствовало о преобладании репаративных процессов, характерных для II фазы раневого процесса. В процессе эксперимента показатель продолжал увеличиваться в контрольной в 4,04 раза и в опытной в 3,4 раза. Однако достоверных отличий в контрольной и опытной группах не выявлено. Клеточный индекс во второй группе был выше, чем в первой на 3-и и 7-е сутки в 1,5 раза, а на 14-е и 21-е сутки в 1,3 раза.
При морфометрическом исследовании с 7 по 21 сутки определяли толщину капсулы вокруг нитей эндопротеза в микрометрах (мкм). На 3-и сутки эксперимента элементы капсулы не определялись в обеих группа. Результаты морфометрического исследования толщины капсулы эндопротеза представлены в таблице 2.
С 7 по 21 сутки как в контрольной, так и в опытной группах отмечали увеличение толщины соединительнотканных капсул в 6,1 и 8,1 раза соответственно. Толщина капсулы после введения аутоплазмы на 7-е сутки была статистически достоверно больше в 1,7, на 10-е в 1,87 и на 21-е сутки в 1,57 раза, чем у животных первой группы.
Микроскопическое изучение гистологических срезов участка передней брюшной стенки с имплантированным легким эндопротезом на 3 сутки у животных в первой группе показало, что в непосредственной близости к нитям эндопротеза клеточный компонент преобладал над волокнистым. В поле зрения визуализировалось большое количество нейтрофилов, лимфоцитов и тучных клеток, находящихся в стадии дегрануляции. Клетки фибробластического ряда, моноциты, макрофаги и плазмоциты были единичные. С наружной и внутренней поверхностей эндопротеза происходила сборка коллагеновых фибрилл в коллагеновые волокна. Коллагеновые фибриллы хорошо определялись в межклеточном матриксе, куда они попадали после отщепления концевых молекул от молекулы тропоколлагена. С наружной поверхности эндопротеза начинался процесс упорядочивания тонких новообразованных коллагеновых волокон несколько раньше, чем с внутренней. Однако вести речь о соединительнотканной перипротезной капсуле пока еще не представлялось возможным (рис. 1А). Во 2-й опытной группе в условиях применения аутоплазмы, обогащенной тромбоцитам, с наружной и внутренней стороны эндопротеза наблюдался процесс упорядочивания и структуризации волокон соединительной ткани по контуру нитей эндопротеза, т.е. начинались этапы образования перипротезной капсулы. Однако, новообразованные волокна были незрелые, тонкие, расположены рыхло (рис. 1Б)
На 7 сутки эксперимента у животных первой группы плотность клеточных элементов на стандартной площади среза была низкая. В поле зрения преобладали фибробласты и лимфоциты. Между нитями эндопротеза зрелых коллагеновых волокон нет. Визуализировались очень тонкие соединительнотканные волокна (рис. 2А). У животных второй группы наблюдалось дальнейшее построение соединительнотканного каркаса вокруг нитей эндопротеза. Тонкие соединительнотканные волокна располагались более упорядоченно и плотно, в сравнении с предыдущим сроком эксперимента. Зрелой, полноценной перипротезной капсулы нет. При этом, преимущественно с наружной стороны эндопротеза определялись более толстые, ярко оксифильные (при окраске по ванн Гизон) коллагеновые волокна. Визуализировались большое количество новообразованных кровеносных сосудов, обеспечивающих хорошую васкуляризацию зоны контакта тканей живого организма с инородным веществом, что так же способствовало более быстрому приживлению импланта (рис. 2Б).
На 10-е сутки эксперимента у животных первой группы процесс приживления импланта протекал не достаточно активно. Непосредственно вокруг нитей эндопротеза выявлены расположенные в несколько рядов крупные гипертрофированные фибробласты со светлой цитоплазмой и темными гиперхромными ядрами. В поле зрения определялись лимфоциты, единичные плазмоциты и моноциты, фиброциты и в большом количестве макрофаги. При окраске по Маллори ядра клеток более яркие и более интенсивно окрашенные, что свидетельствует об активных синтетических процессах в клетке. Вокруг пучков нитей легкого эндопротеза новообразованная капсула недостаточно зрелая. Отсутствует выраженная послойность в ее строении (рис. 3А). В условиях введения аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, вокруг нитей эндопротеза формировалась соединительнотканная капсула с подразделением на слои. Во внутреннем клеточном слое перипротезной капсулы встречались преимущественно только клетки фибробластического ряда, а в наружном – незрелые коллагеновые волокна. Вокруг нитей эндопротеза плотность клеток более высокая, чем без использования плазмы (рис. 3Б).
На 14 сутки у животных первой группы начинала формироваться тонкая соединительнотканная капсула, образованная незрелыми соединительнотканными волокнами. Капсула неоднородная, наблюдается чередование клеточных и волокнистых слоев, что в свою очередь свидетельствует о меньшей плотности и прочности капсулы. В поле зрения определялось очень много фибробластов, встречались лимфоциты, единичные нейтрофилы и плазмоциты. Рядом с новообразованными кровеносными сосудами, расположенными вокруг нитей и между ними, локализовались достаточно крупные тучные клетки, находящиеся в стадии дегрануляции (рис. 4А). У животных второй группы на этом сроке происходило образование не только зрелой и достаточно мощной соединительнотканной перипротезной капсулы, но и появление качественных отличий в ее строении. Внутренний клеточный слой представлен клетками фибробластического ряда, единичными лимфоцитами, плазмоцитами и макрофагами. Наружный, волокнистый слой образован зрелыми (при окраске по ванн Гизон - ярко оксифильные) коллагеновыми волокнами, расположенными плотно, компактно и параллельно друг другу в одном направлении (рис. 4Б).
На 21-е сутки у животных первой группы продолжалось формирование незрелой соединительнотканной перипротезной капсулы. Слои капсула плохо дифференцируются. В наружном слое определялись упорядоченно расположенные рыхлые недостаточно зрелые коллагеновые волокна. Внутренний слой содержал преимущественно клетки фибробластического ряда, лимфоциты, единичные плазмоциты и макрофаги. Клеточный слой широкий, плотность клеток в нем высокая (рис. 5А). У животных второй группы на этом сроке происходило дальнейшее преобразование перипротезной капсулы. Плотный соединительнотканный каркас образован зрелыми коллагеновыми волокнами, расположенными компактно и параллельно друг к другу. Хорошо выражено послойное строение соединительнотканной капсулы. Во внутреннем слое визуализировались клетки фибрабластического ряда, в наружном – волокнисто-зрелые коллагеновые волокна, окрашивающиеся в ярко оксифильный цвет при окраске по ванн Гизон (рис. 5Б).
Разработанная технология стимуляции репаративных процессов плазмой, обогащенной тромбоцитами, при эндопротезировании брюшной стенки обладает рядом преимуществ. Первым преимуществом является оптимизация репаративных процессов в зоне имплантации протеза. Проведенные ранее исследования показали, что зрелая соединительнотканная капсула вокруг легкого материала образуется не ранее чем через 4 недели от момента имплантации [15]. Введение аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, позволяет быстро в течение 2-х недель сформировать прочную соединительнотканную капсулу вокруг легкого импланта. Следовательно, процессы вживления легкого материала в ткани реципиента ускоряются в 2 раза. Второе преимущество – безопасность манипуляции для реципиентов, так как используются аутологические клетки крови, не вызывающие побочных эффектов при их введении. Третье преимущество – низкая себестоимость процедуры. Затраты на получение аутоплазмы минимальны и не повышают стоимость лечения пациента с вентральными грыжами. Четвертое преимущество – простота технологии миниинвазивного лечения, которая доступна для выполнения как в любом хирургическом стационаре, так и в амбулаторных условиях.
Заключение
Введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, для стимуляции репаративных процессов при имплантации легких синтетических материалов в брюшную стенку патогенетически обосновано и эффективно.

About the authors

BORIS Semenovich Sukovatykh

Kursk state medical University

Author for correspondence.
Email: SukovatykhBS@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-2197-8756
SPIN-code: 8778-1530

Ph.D., Professor, head of chair of General surgery Kursk state medical University

Russian Federation, 305041, Russian Federation, Kursk, Karl Marx Street, 3

MARIA Alexeevna Zatolokina

Kursk state medical University

Email: ZatolokinaMA@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0002-9553-1597
SPIN-code: 4997-9700

Doctor of Medical Sciences,  Associate Professor of the Department of Histology, Embryology and Cytology

Russian Federation, 305041, Russian Federation, Kursk, Karl Marx Street, 3

Tamara Viktorovna Mutova

Kursk State Medical University

Email: MutovaTV@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0002-6414-3989
SPIN-code: 5762-9189

assistant of the Department of General Surgery

Russian Federation, 305041, Russian Federation, Kursk, Karl Marx Street, 3

Nelli M Valuyskaya

Kursk State Medical University

Email: ValuiskayaNM@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-3902-4440
SPIN-code: 1738-4824

Candidate of Medical Sciences, assistant of the Department of General Surgery

Russian Federation, 305041, Russian Federation, Kursk, Karl Marx Street, 3

Valeriy Anatolievich Zhukovsky

St. Petersburg State University of industrial technologies and design

Email: rdd.lintex@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7092-9155
SPIN-code: 7681-4053

Doctor of Technical Sciences, Professor of the Department of nanostructured, fibrous and composite materials named after A.I. Meos, scientific supervisor of the laboratory of polymeric materials

Russian Federation, 191186, Russia, St. Petersburg, Bolshaya Morskaya street, 18

References

Supplementary files