Microbiological diagnostic criteria of infectious inflammatory complications after total knee replacement in the aspect of periprosthetic joint infection (PJI) pathogenesis

Full Text

Частота инфекционно-воспалительных осложнений после первичного эндопротезирования коленного сустава по данным разных авторов колеблется от 1,5 до 5,7% [1, 2]. Достаточный разброс авторских данных во многом обусловлен отсутствием специфических диагностических критериев, патогномоничных для перипротезной инфекции, поэтому диагностика инфекционно-воспалительных осложнений после первичного эндопротезирования остается сложной и недостаточно стандартизированной процедурой [3, 4].
Микробиологической диагностике имплантат-ассоциированной инфекции отводится одна из основных ролей в верификации диагноза, однако существуют определенные трудности, связанные с особенностями патогенеза, которые определяются способностью ее возбудителей к бактериальной адгезии на биогенных и абиогенных поверхностях с последующим формированием биопленки [4, 5, 6]. Микроорганизмы в составе биопленки защищены полисахаридным матриксом, характеризуются сниженным метаболизмом и замедленным ростом, высоким уровнем антибиотикорезистентности, минимальным их содержанием в образце клинического материала [5-8]. Антибактериальная терапия, проводимая в течение предшествующих 3 месяцев еще более снижает вероятность роста возбудителей при микробиологическом исследовании [9-11]. Имеющиеся патогенетические особенности позволяют выделить имплантат-ассоциированную инфекцию в практической ортопедии в отдельную категорию со своим этиологическим спектром возбудителей, уровнем их резистентности и консенсусными критериями диагностики [12, 13].
Существующие стандартные бактериологические методики не обладают достаточной информативностью в отношении возбудителей, образующих биопленки, а также низковирулентных штаммов, характерных для подострой и хронической инфекции, возникающей вокруг имплантатов [5, 8]. До настоящего времени не разработана научно обоснованная система микробиологической диагностики имплантат-ассоциированной инфекции, позволяющая своевременно выявлять развитие инфекционно-воспалительных осложнений после первичного эндопротезирования крупных суставов и провести дифференциальный диагноз перипротезной инфекции и асептического воспаления.
Цель исследования. Выявить значимые критерии микробиологической диагностики инфекционных осложнений после первичного эндопротезирования коленного сустава и оценить диагностическую информативность исследования образцов различного клинического материала с учетом патогенетических особенностей имплантат-ассоциированной инфекции.
Материалы и методы
Проведен ретро- и проcпективный анализ результатов микробиологического исследования клинического материала от 182 пациентов с глубокой перипротезной инфекцией после первичного эндопротезирования коленного сустава, находившихся на лечении в НИИТОН СГМУ в период с 2014 по 2018 гг., диагноз был подтвержден на основании клинических, лабораторных и инструментальных методик.
Материалом для микробиологического исследования были отделяемое свищей, поверхностных и интраоперационных ран, тканевые биоптаты, аспират из полости сустава, смывная жидкость с удаленных компонентов эндопротеза после ультразвуковой обработки.
Взятие материала из поверхностных и интраоперационных ран осуществляли стерильными тампонами Transport swab w/o medium (Citoswab, China). Взятие тканевых биоптатов проводили интраоперационно (из 3–5 точек для каждого пациента) общим объемом около 1 см3 в одноразовый стерильный пластмассовый контейнер. Биоптаты взвешивали для количественного исследования, гомогенизировали, готовили разведения биоматериала, высевали по 0,3 мл на плотные и жидкие питательные среды. Для неколичественного исследования фрагменты биоптата помещали в жидкие питательные среды, избегая контаминации образцов. Повторные высевы на плотные питательные среды проводили на 5-е и 14-е сутки. Удаленные компоненты эндопротеза помещали в стерильный пакет, добавляли 50-100 мл стерильного раствора 0,9% NaCl, обрабатывали с помощью ультразвуковой установки «УЗУМИ-2» причастоте ультразвуковых колебаний 37 кГЦ в течение 10 минут, затем жидкость высевали в количестве 0,3 мл на плотные питательные среды и тиогликолевую среду.
Выделение и идентификацию микроорганизмов осуществляли по общепринятой методике (Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений»). Высев исследуемого материала производили на селективные и диференциально-диагностические питательные среды: 5%-ный кровяной агар (основа агара Agar nutrient (Becton Dickinson, США)), среда Эндо (Endo Agar, Special (Hi Media, Индия)), желточно-солевой агар (основа агара Gelatin Mannitol Salt Agar (Staphylococcus agar №110) (Hi Media, Индия). Все посевы инкубировали при 37°С до 14-ти суток. После окончания инкубации при появлении бактериального роста изучали морфологические, культуральные и тинкториальные свойства микроорганизмов; для дифференциации бактерий проводили окраску по Граму (набор реагентов для окраски по Граму (ЭКОлаб., Россия)). Идентификацию возбудителей проводили на микробиологическом анализаторе BD BBL™ Crystal™ AutoReader (Becton Dickinson, США) с применением панелей CrystalTM Enteric/Nonfermenter ID Kit (Becton Dickinson, США), Crystal TM Gram-Positive ID Kit (Becton Dickinson, США). Для пробоподготовки использовали Densi-La-Meter (Pliva-Lachema Diagnostika, Чехия), предназначенный для определения мутности бактериальной взвеси в единицах по МакФарланду (от 0,0 до 15). Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам проводили диско-диффузионным методом согласно МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В исследовании использовали питательную среду Mueller-Hinton-Agar (Becton Dickinson, США) и сенси-диски с антибиотиками (Becton Dickinson, США). Чувствительность к метициллину определяли с использованием набора «MeReSa Agar Base, MRSA AlertTM» (Hi Media, Индия) в соответствии с инструкцией по использованию.
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics 20. Большинство полученных нами данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому взаимосвязь между качественными признаками устанавливали путем выявления взаимной сопряженности, для чего определяли критерий χ2 . Рассчитывали показатель достоверности р, значения которого считали статистически достоверными при р<0,05, что соответствует требованиям, предъявляемым к медико-биологическим исследованиям.
Результаты и их обсуждение
Изучено 412 образцов клинического материала от 182 пациентов с глубокой перипротезной инфекцией после первичного эндопротезирования коленного сустава. При инкубации бактериологических посевов клинического материала в течение 7 дней в 58,3% образцов была выделена монокультура микроорганизмов, в 11,5% - микробная ассоциация; не дали бактериального роста 30,2% образцов. Преобладающими возбудителями в структуре перипротезной инфекции были грамположительные кокки, которые составили 78,3% от общего числа выделенных штаммов, из них представители рода Staphylococcus - 51,8%. Для выявления возбудителей с замедленным ростом сроки инкубации были продлены до 14-ти дней, что позволило выявить клинически значимые микроорганизмы дополнительно в 8,2% образцов клинического материала.
Микробиологическим подтверждением перипротезной инфекции считали выделение представителей низковирулентной флоры, фенотипически идентичных по результатам общепринятых бактериологических тестов и чувствительности к антибиотикам, из двух и более образцов клинического материала; или высев высоковирулентного микроорганизма (S. aureus, P. aeruginosa) из одного образца клинического материала. Выделение низковирулентных возбудителей перипротезной инфекции, таких, как коагулазонегативные стафилококки, из одного образца биоматериала или удаленной конструкции не расценивали как доказательство наличия перипротезной инфекции. У 28 пациентов результаты микробиологического исследования отделяемого ран, тканевых биоптатов и аспирата из полости сустава были идентичны.
На этапе дооперационной диагностики выполнялось микробиологическое исследование отделяемого свища, поверхностной раны (при их наличии) и пунктата из сустава. Из отделяемого поверхностных ран и свищевых ходов были выделены микроорганизмы у 43 пациентов, среди них большой удельный вес имели представители низковирулентной флоры, у этих пациентов микробиологический диагноз перипротезной инфекции был подтвержден выделением идентичных возбудителей из других образцов клинического материала. У 11 пациентов из отделяемого поверхностных ран и свищевых ходов однократно были выделены слабовирулентные возбудители, но другие методы микробиологического исследования роста не дали, что свидетельствовало о контаминации образцов микрофлорой кожных покровов. Использование данного критерия микробиологической диагностики перипротезной инфекции не является высокоспецифичным (63%) и может привести к неправильной интерпретации результатов исследования.
Исследование пунктата или синовиальной жидкости на этапе дооперационной диагностики входит в стандарты исследований при изучении инфекционно-воспалительных осложнений после первичного эндопротезирования крупных суставов. При бактериологическом исследовании аспирата из полости сустава микроорганизмы были найдены у 54 пациентов; дополнительно к результатам исследования отделяемого поверхностных ран и свищей клинически значимые микроорганизмы были выявлены в 11 образцах пунктатов. Учитывая, что возбудители перипротезной инфекции часто находятся в виде биопленки и не попадают в синовиальную жидкость, информативность этого метода не всегда бывает достаточной. Специфичность этого метода исследования выше, чем исследования отделяемого поверхностных ран и свищей - 89%. Полученные данные по информативности данных методик микробиологического исследования представлены в таблице 1.
На этапе ревизии эндопротеза при микробиологическом исследовании отделяемого интраоперационной раны перипротезная инфекция была подтверждена микробиологически у 45 пациентов. Исследование клинического материала, взятого тампоном из операционной раны, в настоящее время применяется реже в связи с малой информативностью, обусловленной особенностями патогенеза, что подтверждается недостаточной чувствительностью метода – 61%.
Взятие интраоперационных образцов перипротезных мягких тканей является в настоящее время «золотым стандартом» диагностики перипротезной инфекции. Для достижения достаточной чувствительности и специфичности от каждого пациента во время операции было взято 3-5 образцов тканей. Начиная с 2015 г. нами была оптимизирована методика культурального посева тканевых биоптатов путем предварительной гомогенизации образцов мягких тканей перед помещением в питательную среду. С помощью исследования биоптатов перипротезной ткани диагноз перипротезной инфекции был подтвержден у 67 пациентов, из них в 17 случаях установить микробиологический диагноз удалось только с использованием данного критерия микробиологической диагностики, при этом исследование пунктата коленного сустава и отделяемого интраоперационной раны не дали бактериального роста. Количество бактериологически подтвержденных случаев перипротезной инфекции суставов при изучении гомогенизированых тканевых биоптатов выше (84,3%), чем при исследовании аспирата из полости сустава (72,4%) (χ2 = 1,987; р < 0,05). У 7 пациентов исследование гомогенизированных биоптатов выявило, наряду с выделенными из пунктата Staphylococcus spp., дополнительно энтеробактерии (E.coli) и неферментирующие грамотрицательные бактерии (Acinetobacter spp.). Исследование тканевых биоптатов является более надежным методом исследования, чем исследование аспирата, как по чувствительности (соответственно 81% и 69%), так и по специфичности (96% и 89% соответственно).
Информативность данного метода возрастает при имплантат-ассоциированной инфекции, обусловленной грамотрицательными бактериями - Enterobacteriaceae, неферментирующими грамотрицательными бактериями (рисунок 1).
Начиная с 2016 г. мы проводили бактериологическое исследование удаленных компонентов эндопротезов. Количество бактериологически подтвержденных случаев перипротезной инфекции суставов при изучении смывной жидкости после ультразвуковой обработки эндопротеза было достоверно выше (93,7%), чем при исследовании биоптатов мягких тканей (84,3%) (χ2 = 1,054; р < 0,05), особенно при выделении представителей грамотрицательных бактерий (рисунок 1). У 14 пациентов микробиологически подтвердить диагноз перипротезной инфекции удалось установить только при исследовании смывной жидкости после ультразвуковой обработки удаленных компонентов эндопротеза, при этом исследование пунктата коленного сустава, отделяемого интраоперационной раны, гомогенизированных образцов перипротезных тканей не дали бактериального роста. Применение данного метода достоверно повышало чувствительность микробиологического исследования в диагностике перипротезной инфекции по сравнению с исследованием тканевых биоптатов (95 и 81% соответственно; χ2 = 2,860; р<0,01) при сохранении высокой специфичности.
Проведенный нами сравнительный анализ информативности различных методик микробиологической диагностики имплантат-ассоциированной инфекции после первичного эндопротезирования коленного сустава позволил выделить несколько аспектов методологии микробиологических исследований, позволяющих повысить информативность диагностики инфекционных осложнений. Для правильной интерпретации результатов исследований необходим комплексный подход, учитывающий особенности патогенеза имплантат-ассоциированной инфекции, структуры исследуемых образцов клинического материала и методологии проведения самих бактериологических исследований. Нами было установлено, что пролонгированное культивирование образцов клинического материала в течение 14 суток увеличивает диагностическую информативность бактериологической диагностики, что обусловлено сниженным метаболизмом и замедленным ростом возбудителей перипротезной инфекции. Выделение низковирулентных микроорганизмов из отделяемого свищей и поверхностных ран требует подтверждения этиологической значимости возбудителей в связи с частой контаминацией образцов микрофлорой кожи. Использование данной методики для диагностики перипротезной инфекции должно быть ограничено в связи с низкой чувствительностью и специфичностью (65 и 63% соответственно).
Исследование аспирата, широко используемое при диагностике перипротезной инфекции, не обладает достаточной чувствительностью, особенно в отношении грамотрицательных бактерий, способных формировать биопленки в костно-эндопротезном пространстве, в результате чего возбудители не взаимодействуют с суставной жидкостью и находятся в ней в минимальном количестве, что значительно затрудняет микробиологическую диагностику. Обработка ультразвуком приводит к разрушению гликокаликса и дезинтеграции колоний микроорганизмов, деструкции ассоциированной с имплантатом микробной биопленки [5, 6], что повышает эффективность микробиологического исследования. Микробиологическое исследование компонентов эндопротеза после ультразвуковой обработки дает не только количественную оценку микробной обсемененности, но и демонстрирует повышение чувствительности в сравнении со всеми указанными выше бактериологическими методами. Использование этого метода бактериологической диагностики улучшает диагностику инфекционно-воспалительных осложнений у пациентов с субклиническим течением инфекционного процесса, который часто бывает расценен как асептическое воспаление.
Посев гомогенизированных тканевых биоптатов и смывной жидкости с удаленных компонентов эндопротеза являются достоверными и информативными методами верификации диагноза перипротезной инфекции и позволяют значительно повысить диагностическую значимость бактериологических исследований, особенно в отношении коагулазонегативных стафилококков и грамотрицательных бактерий, часто существующих в виде биопленок при перипротезной инфекции [1, 5, 6].
Выводы
Применение в ходе выделения и идентификации возбудителей перипротезной инфекции увеличенного времени культивирования образцов, посева 3-5 гомогенизированных тканевых биоптатов, ультразвуковой обработки удаленных ортопедических имплантатов позволяют диагностировать перипротезную инфекцию при субклиническом течении, в том числе ее тип, характеризующийся бессимптомной бактериальной колонизацией поверхности эндопротеза, выявленной во время ревизионной операции (классификация Tsukayama D.T., 1996). Комплексная оценка результатов и изменение методологии бактериологического исследования обеспечивают достаточную информативность микробиологической диагностики инфекционных осложнений после первичного эндопротезирования коленного сустава.

About the authors

Irina Vladimirovna Babushkina

 Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neuosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University, Russia.

Author for correspondence.
Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6740-1050
SPIN-code: 8777-6795

Cand.Med. Sci., Senior Research Assistant in the Department of Fundamental, Clinical and Experimental Studies, Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University

Russian Federation, 148, Chernyshevskogo Str., Saratov, 410002, Russia

Aleksandr Sergeevich Bondarenko

Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neuosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University, Russia.

Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6345-1851
SPIN-code: 6719-4520

Vice-Dean of General Medicine Department and Clinical Psychology Department of Razumovsky Saratov State Medical University

Russian Federation, 148, Chernyshevskogo Str., Saratov, 410002, Russia.

Sergey Petrovich Shpinyak

Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neuosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University, Russia.

Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0345-6287
SPIN-code: 6540-1764

Cand.Med. Sci., Junior Research Assistant in the Department of Traumatological and Orthopedic Innovations of Research Institute of Traumatology, Othopedics and Neurosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University.

Russian Federation, 148, Chernyshevskogo Str., Saratov, 410002, Russia.

Irina Aleksandrovna Mamonova

Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neuosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University, Russia.

Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3941-4334
SPIN-code: 7957-2955

Cand.Med. Sci., Junior Research Assistant in the Department of Fundamental, Clinical and Experimental Studies Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University.

Russian Federation, 148, Chernyshevskogo Str., Saratov, 410002, Russia.

Ervin Serveevich Kuzmin

Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neuosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University, Russia.

Email: 10051968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3476-8005
SPIN-code: 1896-8669

Post-Graduate Student, Research Institute of Traumatology, Orthopedics and Neurosurgery of Razumovsky Saratov State Medical University

Russian Federation, 148, Chernyshevskogo Str., Saratov, 410002, Russia.

References

Supplementary files