Influence of immobilized form of sodium hypochlorite on the functional condition of internal organs, systemic inflammatory response, oxidative stress, antioxidant protection and dysfunction of endothelium in experimental infected pancreonecrosis

Full Text

Одной из проблем панкреатологии является лечение инфицированного панкреонекроза (гнойно-некротического парапанкреатита), летальность при котором колеблется от 40% до 60% [1, 2]. Применяемые в настоящее время миниинвазивные способы крупнокалиберного дренирования гнойных очагов и программированные хирургические санации забрюшинной флегмоны не привели к существенному улучшению результатов лечения больных [3, 4, 5]. Первой причиной высокой летальности является возросшая резистентность микроорганизмов к водным растворам антисептиков, которые применяются для санации гнойных очагов [6]. Микроорганизмы в гнойных очагах образуют биопленку, которая защищает их от воздействия антибиотиков и антисептиков. Работами последних лет показано, что для проникновения лечебного препарата через биопленку микроорганизмов, необходимо длительное лекарственное воздействие, которое можно создать применением пролонгированных иммобилизированных антисептиков[7]. К подобным антисептическим препаратам относится официнальная мазь «Левомеколь», основным антисептическим компонентом которой является хлорамфеникол и разработанная в нашей клинике иммобилизированная форма гипохлорита натрия в геле полимера.
Второй причиной высокой летальности является повреждающее действие эндотоксинов из гнойного очага, вызывающее дисфункцию внутренних органов и эндотелия сосудов, системный воспалительный ответ, окислительный стресс и в конечном итоге полиорганную недостаточность [8, 9]. Влияние иммобилизированных антисептиков на функциональное состояние внутренних органов, воспалительный ответ, окислительный стресс, антиоксидантную защиту и эндотелиальную дисфункцию до настоящего времени не изучено.
Цель исследования - изучить влияние иммобилизированной формы гипохлорита натрия на функциональное состояние внутренних органов, системный воспалительный ответ, окислительный стресс, антиоксидантную защиту и эндотелиальную дисфункцию при экспериментальном инфицированном панкреонекрозе.
Материалы и методы
Экспериментальноеисследование проводилось на 60 белых крысах-самцах линии Вистар массой 200-250 г без признаков заболевания в полном соответствии с «Конвекцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» принятой Советом Европы «Страсбург, Франция,1986г. Экспериментальные животные были разделены на 3 группы по 20 особей в каждой: контрольную, сравнения, опытную. Иммоблизированная форма гипохлорита натрия в геле метилцеллюлозы готовилась следующим образом. К 150 мл 3% геля метилцеллюлозы, выпускаемого ООО «Линтекс», г. Санкт-Петербург, под названием «Гель противоспаечный, рассасывающейся «Линтекс-Мезогель», стерильный» добавляли 50 мл 0,12% раствора гипохлорита натрия. Концентрация последнего в полученном геле составляла 0,06% и соответствовала рекомендованной для внутриполостного введения.
Моделирование инфицированного панкреонекроза осуществлялось следующим образом [10].
На первом этапе производили лапаротомиюпараректальным разрезом слева длинной до 2сми формировали ограниченную полость из наружной и внутренней косых мышц на передней брюшной стенки. На втором этапе из брюшной полости извлекали комплекс поджелудочной железы и селезенки. На третьем этапе производили травматизацию поджелудочной железы путем криодеструкции по следующей методике. В сосуд Дюара, содержащий жидкий азот с температурой – 8000. С, на 40 сек, погружали аппликатор с площадью рабочей поверхности 0,6 см2, при погружении аппликатор держали за шелковую нить. После извлечения из жидкого азота, аппликатор захватывали пинцетом, и на 5 сек. прижимали к левой доле поджелудочной железы, так, чтобы избежать контакта с селезеночными сосудами. После замораживания поджелудочной железы дожидались ее оттаивания. На четвертом этапе комплекс поджелудочной железы и селезенки погружался в заранее сформированную межмышечную полость на передней брюшной стенке. На пятом этапе в полость вводили 1 млрд. микробной взвеси золотистого стафилококка в объеме 0,3 мл и устанавливали фистулу для последующего введения лекарственных веществ. Установленная фистула частично укрывалась кожей. В контрольной группе лечение не проводилось. Со вторых суток экспериментальным животным через фистулу 1 раз в день в группах сравнения и опытной группе вводился антисептик в объеме 0,3 мл. В группе сравнения в инфицированный участок поджелудочной железы вводилась стандартная мазь «Левомеколь»(0,3мл), а в опытной группе – иммобилизированная форма гипохлорита натрия в геле карбоксиметилцеллюлозы (0,3 мл).
Животные выводились из эксперимента на 3-е, 5-е,7-е и 10-е сутки. Забор крови для биохимических исследований осуществляли у 5 выживших животных на каждом сроке путем пункции полости сердца перед выведением животного их эксперимента. Объем крови составлял 7-8мл. Определяли стандартные показатели функции почек (мочевину, креатинин), поджелудочной железы (панкреатическую амилазу), печени (щелочную фосфатазу) по стандартным методикам.
Исследовали показатели свободного радикального окисления липидов (ацилгидроперекиси и малоновыйдиальдегид), эндотелиальной дисфункции (оксид азота), антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазу, общую антиокислительную активность), системноговоспалительного ответа (С-реактивный белок).
Супероксиддисмутаза (СОД) – антиоксидантный фермент, концентрацию которого определяли фотометрическим методом и выражали в условных единицах (у.ед.). Общая антиокислительная активность (ОАА) – это совокупность реакций,тормозящих свободнорадикальное окисление липидов. ОАА определяли методом основанным на степени ингибирования аскорбат- и ферроиндуцированного окисления твина -80 до МДА. Оптическую плотность измеряли при 532 нм через 48 ч инкубации при 40 С.Малоновыйдиальдегид (МДА) - конечный продукт перекисного окисления липидов (ПОЛ). Концентрацию МДА в плазме определяли спектрофотометрически после экстракции бутанолом с помощью наборов «ТБК-Агат». Результаты выражали в мкмоль/л.Определение ацилгидроперекисей (АГП) -промежуточных продуктов ПОЛ - производили после экстракции смесью гептана и изопропаноласпектрофотометрическим методом при длине волны 233 нм против контрольной пробы. Выражали концентрацию в условных единицах.Определение стабильных конечных метаболитов оксида азота (NO) в биологических жидкостях проводили спектрофотометрически при длине волны 540 нм с реактивом Грисса.С-реактивный белок (СРБ) – неспецифический индикатор воспаления, показывающий выраженность воспалительной реакции, определяли спектрофотометрическим методом и выражали в мг/л.
Количественные результаты исследования обрабатывали статистически с использованием аналитического пакета приложения ExcelOffice 2010. Проверку на нормальность распределения проводили по способу Шапиро-Уилка. При нормальном распределении статистическую значимость различий осуществляли с помощью критерия Стъюдента. В случаях с распределением, отличающимся от нормального, применяли критерий Уилкоксона и Манни-Уитни. Различия считали статистически достоверными при P<0.05.
Результаты и их обсуждение
Динамика амилазы крови у экспериментальных животных представлена в таблице 1.
В контрольной группе на всех сроках эксперимента зарегистрирована выраженная ферментемия с повышением панкреатической амилазы на 3 –е в 5, на 5-е в 1,5, на 7-е в 5,6, на 10-е сутки в 5,7 раза, что свидетельствовало о наличии активного воспаления поджелудочной железы. При введении мази «Левомеколь» в гнойный очаг амилаза была выше нормы на 3-е в 3,5, на 5-е в 2,8, на 7-е – в 1,7, и на 10-е сутки – в 1,3 раза. Следовательно в группе сравнения к концу эксперимента сохранялись явления воспаления в поджелудочной железе. При введении в полость иммобилизированной формы гипохлорита натрия уровень амилазы крови была выше нормальных значений на 3- е в 2,8, на 5-е – в 2,5, на 7 –е – в 1,5, и на 10-е сутки – в 1,03 раза. Снижение уровня ферментемии в опытной группе свидетельствует о купировании воспаления в поджелудочной железе. При сравнении уровня ферментемии в экспериментальных группах установлено, что противовоспалительная активность иммобилизированной формы гипохлорита натрия превосходила мазь «Левомеколь»на 3-е сутки эксперимента в 1,3 раза, на 5-е – в 1,1, на 7-е – в 1,1, на 10-е сутки – в 1,3 раза.
Динамика биохимических показателей функции почек у экспериментальных животных представлена в таблице 2.
У животных в контрольной группе на всех сроках эксперимента сохранялся высокий уровень креатинина на 3-е – в 1,4, на 5-е – в 4,9, на 7-е – в 4,9, на 10-е сутки – в 5 раз выше нормы.Аналогичным образом повышался уровень мочевины крови на 3-е – в 3, на 5-е - в 4,1, на 7-е – в 4,9, на 10-е сутки - в 6,7 раза. Полученные данные свидетельствуют о резком нарушении функции почек при инфицированном панкреонекрозе. В группе сравнения уровень креатинина повышался на 3-е – в 3,2, на 5-е – в 3, на 7-е – в 2,8, на 10-е сутки - в 2,1 раза, а уровень мочевины соответственно: на 3-е – в 3,4, на 5-е - в 2,5, на 7-е - в 2,4, на 10-е сутки- в 2,2 раза. Дисфункция почек в группе сравнения сохранялась на всех сроках эксперимента. В опытной группе, при введении уровень креатинина повышался на 3-е – в 2,8, на 5-е – в 2,6, на 7-е – в 1,7, на 10-е сутки – в 1,2 раза, а уровень мочевины крови соответственно: в 2,4, в 2,7, в 2,1 и в 1,5 раза. Хотя дисфункция почек и сохранялась к концу эксперимента в опытной группе, но она была менее выражена, чем в группе сравнения к 10-м суткам в 0,7 раза.
Динамика показателя функции печени представлена в таблице 3.
У животных в контрольной группе на всех сроках эксперимента сохранялся высокий уровень щелочной фосфатазы на 3-е – в 2,9, на 5-е – в 3,0, на 7-е – в 3,2, на 10-е сутки – в 2,96 раз относительно нормы, что свидетельствует о печеночной недостаточности на всех сроках эксперимента. В группе сравнения при введении мази «Левомеколь» уровень щелочной фосфатазы повышался на 3-е – в 2,51, на 5-е – в 2,41, на 7-е – в 1,8, на 10-е сутки - в 1,6 раза. Дисфункция печени в группе сравнения сохранялась на всех сроках эксперимента, но была менее выражена, чем в контрольной группе. В опытной группе, при введении иммобилизированной формы гипохлорита натрия уровень щелочной фосфатазы повышался на 3-е с – в 2,3, на 5-е – в 2, на 7-е – в 1,5, на 10-е сутки – в 1,2 раза. Хотя дисфункция печени и сохранялась к концу эксперимента в опытной группе, но она была менее выражена, чем в группе сравнения к 10-м суткам в 1,3 раза.
Динамика С-реактивного белка у экспериментальных животных представлена в таблице 4.
На всех сроках эксперимента у животных контрольной группы сохранялся высокий уровень СРБ на 3-е сутки выше нормы в 131,8 раза, на 5-е – в 84,6, на 7-е – в 123,1, на 10-е сутки – в 129,4 раза, что свидетельствовало о высокой интенсивности воспалительного процесса. В группе сравнения уровень СРБ по сравнению с контрольной группой был ниже на 3-е - в 1,03, на 5-е - в 3,8, на 7-е – в 24,8 и на 10-е сутки –в 35 раз. В опытной группе уровень СРБ был ниже чем в контрольной группе на 3- е - 1,07, на 5-е - в 5,3, на 7-е - в 32, на 10-е сутки- в 51,4 раза. Снижения уровня СРБ отмечалось в группе сравнения и опытной группе. В опытной группе уровень СРБ был ниже, чем в группе сравнения на 3-е – 1,1, на 5-е - в 1,38, на 7-е - в 1,2, на 10-е сутки- в 1,48 раза ниже ,что свидетельствовало о более выраженном снижении воспалительного ответа и большей вероятности благоприятного исхода течения заболевания.
Динамика показателей окислительного стресса представлены в таблице 5.
В контрольной группе на всех сроках эксперимента отмечалось повышение концентрации АГП по сравнению с нормальными значениями: на 3-е в 29,1, на 5-е в 42, на 7-е 53 и на 10-е сутки в 27 раз. Динамика АГП свидетельствовала о наличии окислительного стресса у животных контрольной группы. При введении мази «Левомеколь» в гнойный очаг концентрация АГП была выше нормы на всех сутках эксперимента: на 3-е в 19,2, на 5-е в 36,7, на 7-е 18,5 раз и на 10-е сутки 15,3 раза. Показатели АГП в группе сравнения были ниже, чем в контрольной на 3-е в 1,4, на 5-е 1,14, на 7-е в 2,89, на 10-е сутки в 1,7 раза.
При введении иммобилизированной формы гипохлорита натрия АГП была выше нормы на всех сутках эксперимента: на 3-е в 5 раз, на 5-е в 5,58, на 7-е 4,6 и на 10-е сутки 2,08 раза. Показатели АГП на всех сутках эксперимента в опытной группе были ниже, чем в группе сравнения на 3-е в 7,8, на 5-е в 6,6, на 7-е 3,96 и на 10-е сутки 7,36 раза.
В контрольной группе на всех сроках эксперимента отмечалось повышение количества МДА: на 3-е в 11,3, на 5-е в 7,7, на 7-е 14,5 и на 10-е сутки 10,5 раза. При введении мази «Левомеколь» в гнойный очаг концентрация МДА была выше нормы на всех сутках эксперимента:на 3-ев 1,4 , на 5-е в 0,9, на 7-е 6,2 и на 10-е сутки 5,3 раза. Свободнорадикальная активность в группе сравнения по сравнению с контрольной группой была ниже: на 3-е в 1,4, на 5-е в 1.1, на 7-е в 2,33, на 10-е сутки в 1,9 раза.
В опытной группе при введении иммобилизированной формы гипохлорита натрия МДА была выше нормы на 5-е в 1,4, на 7-е и 1,9 и на 10-е сутки 1,3 раза. Свободнорадикальная активность и выраженность эндотоксикоза в опытной группе была ниже чем в группе сравнения на 3-е в 9,9, на 5-е в 5,7, на 7-е 3,3 и на 10-е сутки 3,8 раза. Динамика МДА была подобной динамике АГП у животных всех групп.
Динамика показателей антиоксидантной защиты представлена в таблице 6.
В контрольной группе на всех сроках эксперимента отмечалось повышение количества СОД: на 3-е в 12,8, на 5-е в 15,9, на 7-е 15,4 и на 10-е сутки 16,9 раза. Динамика СОД свидетельствовала об активации антиоксидантной защиты в ответ на окислительный стресс. В группе сравнения при введении мази «Левомеколь» в гнойный очаг концентрация СОД была выше нормы на всех сутках эксперимента: на 3-е в 20,7, на 5-е в 20,3, на 7-е 18,6 и на 10-е сутки 23,5раза. В опытной группе при введении иммобилизированной формы гипохлорита натрия СОД была выше нормы на всех сутках эксперимента: на 3-е в 19,9, на 5-е в 24,6, на 7-е 24,8 и на 10-е сутки 26,3 раза.
Антиоксидантная защитная реакция в опытной группе остается стабильно высокой на всех сроках эксперимента. Показатели антиоксидантной защиты в группе сравнения также остаются стабильно высокими на всех сроках эксперимента, но к 10-м суткам на 1,13 раза ниже чем в опытной группе.
Динамика общей антиокислительной активности была следующая. Во всех экспериментальных группах отмечалось снижение ОАА: в контрольной группе на 3-е в 2,2, на 5-е и 7-е в 2,3 и на 10-е сутки в 1,9 раза; в группе сравнения соответственно в 2,5 раза, 2,2 раза, 2 и 1,8 раза; в опытной группе в 2, 1,4, 1,3 и 1,1 раза. Антиокислительная активность в опытной группе была выше, чем в группе сравнения на 3-е в 1,3, на 5-е в 1,6, на 7-е в 1,6 и на 10-е сутки в 1,6 раза.
В контрольной группе отмечались стабильно низкие показатели ОАА на всех сроках эксперимента. В опытной группе с третьих суток отмечалось постепенное восстановление уровня ОАА, который к концу эксперимента составил 29,49±0,75% ,что на 1,6 раза выше, чем в группе сравнения и в 1,13 раза ниже нормальных показателей.
Динамика показателя дисфункции эндотелия сосудов представлена в таблице 7.
В контрольной группе на всех сроках эксперимента отмечено повышение уровня NO: на 3-е и 5-е сутки в 2,9, на 7-е в 3,4 и на 10-е сутки 2,5 раза. У животных в группе сравнения на 3-е сутки эксперимента уровень оксида азота был выше нормы в 2,4 раза, на 5-е в 2,3 раза, а затем приходил к норме.
В опытной группе исследуемый показатель на 3-е и последующие сутки эксперимента не имел тенденции к повышению и оставался на всех сроках на стабильно низких уровнях приближенных к нормальным.
Динамика лабораторных показателей позволила установить общее позитивное воздействие иммобилизированной формы гипохлорита натрия на дисфункцию поджелудочной железы, печени, почек, системный воспалительный ответ. Особый интерес представляет изучение влияния гипохлорита натрия на свободнорадикальное окисление липидов. Результаты экспериментального исследования показали, что при инфицированном панкреонекрозе развивается резко выраженный окислительный стресс. Возникает естественный вопрос. Можно ли вводить в очаг инфекции гипохлорит натрия, имеющий свободный кислородный радикал, который способен усугублять свободнорадикальное окисление липидов? Результаты выполненного исследования зарегистрировали парадоксальную реакцию – активный радикал кислорода гипохлорита натрия подавлял окислительный стресс, стимулировал антиоксидантную защиту. Такое действие можно объяснить выраженной антиэндотоксической активностью гипохлорита натрия: подавляя действие эндотоксинов он нормализует липидный обмен [11]. Особенно позитивно проявлялось действие иммобилизированной формы гипохлорита натрия на дисфункцию эндотелия сосудов. На всех сроках эксперимента концентрация оксида азота не превышала нормальных значений.
Заключение
Применение иммобилизированной формы гипохлорита натрия при экспериментальном инфицированном панкреонекрозе позволяет устранить дисфункцию внутренних органов и эндотелия сосудов, снизить выраженность воспалительного ответа и окислительного стресса, активизировать антиоксидантную защиту.

About the authors

Boris Semyonovich Sukhovatih

Kursk state medical University

Author for correspondence.
Email: SukovatykhBS@kursksmu.net
ORCID iD: 0000-0003-2197-8756

Ph.D., Professor, head of chair of General surgery Kursk state medical University

Russian Federation, Karl Marx str., 3, Kursk, 305041, Russian Federation 

Elena Alexandrovna Elenskaya

Kursk state medical University

Email: e.elenskay@yandex.ru

postgraduate of the Department of General Surgery

Russian Federation, Karl Marx str., 3, Kursk, 305041, Russian Federation 

Yuriy Yurievich Blinkov

Kursk state medical University

Email: blinkov_you@mail.ru

M.D., professor of the Department of General Surgery

Russian Federation, Karl Marx str., 3, Kursk, 305041, Russian Federation 

Oleg Vladimirovich Alimenko

Kursk state medical University

Email: alimenkoov@kursksmu.net

Ph.D., assistant of the Department of General Surgery

Russian Federation, Karl Marx str., 3, Kursk, 305041, Russian Federation 

References

Supplementary files