Major Characteristics of Experimental Models of Abdominal Adhesions

Full Text

Поиск способов лечения и профилактики спаек брюшной полости и спаечной болезни, частота развития которой, по данным исследований, колеблется от 18-20 до 64 -80 % [1, 2], является одними из важнейших задач фармацевтической и медицинской науки. Однако, одним из препятствий для исследования патогенеза и апробации возможных способов лечения спаечной болезни является отсутствие устойчивых, хорошо воспроизводимых и, вместе с тем, общепринятых экспериментальных моделей.
Цель
Анализ и систематизация экспериментальных моделей спаечного процесса в брюшине, применимых для мелких лабораторных животных (крыс, мышей и кроликов), доступных в вивариях научных, лечебных и образовательных учреждений.
Видовые особенности экспериментальных
животных
Необходимо подчеркнуть, что, как при постановке, так и при анализе результатов исследований, необходимо учитывать видовые особенности экспериментальных животных, которые могут существенно влиять на течение эксперимента и затруднять экстраполяцию результатов. У животных, в зависимости от вида, отличаются толщина брюшины, ее площадь, объём перитонеальной жидкости и активность фибринолиза.
Относительная толщина брюшины и подлежащего мышечного слоя, а также наличие субмезотелиальных и фиброэластичных тканей определяет возможность тканей противостоять повреждающему действию. Считается, что у мышей толщина всей брюшной стенки приблизительна равна толщине первого мышечного слоя у крыс, толщина брюшной стенки у крыс - толщине первого мышечного слоя у кроликов, толщина брюшной стенки у кроликов - мышечного слоя у собак [3].
Общая площадь брюшины примерно равна площади кожных покровов, при этом, соотношение площади к массе тела больше у мелких животных, чем у крупных. Объём перитонеальной жидкости, требуемый для покрытия всей поверхности брюшины у мелких животных непропорционально велик по сравнению с крупными, а всасывание и элиминация чужеродных молекул из брюшной полости осуществляется намного быстрее [3]. Существенные видовые различия также касаются фибринолитической активности: наиболее высокая активность отмечается у крыс и морских свинок, в то время как у кроликов она практически не определяется [4]. При этом, ответ на стрептокиназу в виде активации фибринолиза и снижения частоты спаек у крыс намного слабее, чем у кроликов, ответ которых максимально приближен к человеческому, а у собак стрептокиназа вообще не влияет на активность сыворотки и частоту спайкообразования [3]. Также экспериментатор должен учитывать и наличие функциональной неоднородности разных отделов желудочно-кишечного тракта. Различная активностью фибринолиза на висцеральной и париетальной частях брюшины приводит к тому, что одинаковые по силе воздействия вызывают более выраженный спаечный процесс в висцеральной части [3]. При этом у крыс фибринолитическая активность выше в неповрежденной висцеральной брюшине, по сравнению с париетальной, однако, при повреждении активности практически выравниваются. Активность фибринолиза разница и между разными отделами кишечника: так, у человека (по экспериментальным животным данные практически отсутствуют), наиболее высокая фибринолитическая активность выявляется в большом сальнике, превосходя минимальные значения (в области желчного пузыря) более чем в четыре раза. Описанная функциональная специализация отдельных зон брюшины и, как следствие, гетерогенность проявляемых свойств, сохраняется даже в условиях патологического процесса, вследствие чего, глубина распространения воспаления, например, при перитоните, сильнее выражена в зоне резорбции, где воспаление доходит до подбрюшинной ткани: мышц диафрагмы, мышечного слоя кишечника и даже его подслизистого слоя [2]. В зоне транссудации воспаление обычно не распространяется за пределы ткани брюшины, а в относительно индифферентной зоне оно бывает только в поверхностных слоях брюшины [2]. Вследствие этого, в экспериментах, при наложении швов на тонкий кишечник, образование спаек происходит практически у всех животных, однако мобильность тонкой кишки приводит к вариабельности локализации спаечного процесса и высокой частоте несостоятельности швов и непроходимости кишечника, что сопровождается трудностью выполнения швов и анастомозов на кишке малого размера (диаметр около 3-4 мм) [5]. В то же время, использование для инициации спайкообразования участков толстого кишечника характеризуется более низким числом осложнений и вариабельностью расположения сформированных спаек.
Вследствие вышесказанного, у мелких экспериментальных животных (крысы, мыши) относительная степень повреждения и интенсивность ответной реакции могут быть значительно более выраженными, чем у более крупных, и в отличие от человека, слепая кишка у грызунов активно участвует в пищеварении, обладая хорошей всасывающей способностью, что может затруднять экстраполяцию результатов на человека [3].
Используемые экспериментальные модели
спайкообразования
Все экспериментальные модели основаны на инициации воспаления вследствие повреждения, и отличия между ними заключаются в методах или действующих агентах, вызывающих повреждение тканей, его характере (однократное или повторяющееся воздействие) и глубине.
Травматизация брюшины в эксперименте может осуществляться как механическим воздействием—путем ее осаднения тупой стороной скальпеля, шкуркой, зубной щеткой или марлей до появления «кровавой росы», так и другими способами, например, с помощью специальных механических приспособлений или электрокоагуляции (с напряжением 60 В) [3-6].
Даже простая резекция участка брюшины с подлежащим мышечным слоем дает положительные результаты, хотя количество спаек сравнительно небольшое, и развития спаечной болезни чаще всего не наблюдается [7]. В качестве примера подобных моделей можно упомянуть методику, при которой осуществляется иссечение ножницами брюшины боковой стенки живота с образованием дефектов на правой и левой половине брюшной стенки [5].
К «хирургическим» методам относят достаточно распространенную тактику, включающую в себя вскрытие серозно-мышечного слоя слепой кишки с последующим ушиванием раны и скарификацей париетальной брюшины бокового канала [8]. В качестве шовного материала в описанных моделях могут применяться как нерассасывающиеся (например, полипроприленовые) [9], так и различные биорезорбируемые шовные материалы [10]. Способ, при котором сегмент париетальной брюшины вырезают, а затем поднимают слепую кишку, предварительно подвергнув ее скарификации, позиционируя ее так, что при закрытии брюшной полости он касался сформированного дефекта брюшины, и подвергают 10-ти минутной экспозиции перед закрытием брюшной полости ведет к 100% появлению спаек [11].
В группе комбинированных моделей, включающих в себя действие нескольких факторов, описана термодесикаризация с нанесением насечек с последующей искусственной ишемией кишечника [12], а также скарификацию совместно с высушиванием [8] и последующей обработкой химическими агентами, например, 95% этиловым спиртом или клеем на основе цианоакрилата. Термообработка серозного покрова высокой температурой (до 800С) ведет к глубокому некрозу брюшины с образованием вокруг него зоны повреждения и развитию спаечной болезни. Считается, что данный способ моделирования спаечного процесса брюшной полости наиболее эквивалентен спаечной болезни человека [12]. Также известен метод, который включает в себя гидравлическую препаровку брюшина вентральной стенки с последующим иссечением брюшины и скарификацией слепой кишки [13], что ведет к появлению висцеро-париетальных и висцеро-висцеральных сращений с развитием дегенеративных процессов в стенке полых органов.
Также, хоть и достаточно редко, в экспериментальной практике спаечная болезнь инициируется с помощью вживленных в организм сеток, аналогичных применяемым в клинике при оперативном лечении грыж [14]. Спайки формируются на 7 сутки эксперимента [14]. Подобных же результатов добиваются и при формировании искусственных грыж, с отличием в том, что спайки формируются на 10 сутки эксперимента [13]. Так, описана модель, когда париетальную брюшину вентральной брюшной стенки справа и слева отслаивают и иссекают, а в лапаратомную рану выводят органокомплекс, состоящий из петель тонкого и толстого кишечника, на основание которого накладывают латексное кольцо на 30 минут [13].
Помимо описанных «хирургических» моделей существует еще целый ряд техник, при которых спайкообразование индуцируется путем введения тех или иных веществ или биологических агентов. Необходимо учитывать, что природа агента оказывает эффект на характеристики спайкообразования, в том числе, и за счет изменения активности фибринолиза. Даже физиологический раствор [16] при его нанесении на брюшину, не только не предупреждает, но и, в случае применения раствора с температурой, выше внутренней температуры тела, потенцирует спайкобразование [17]. Более того, введение физиологического раствора (или орошение им поверхности брюшины) приводит к накоплению в невсосавшейся жидкости макрофагов и эозинофилов, сопровождается повышением уровня MCP-1 и TNF на фоне нарушения пролиферации мезотелиальных клеток, чем способствует усилению и генерализации возникшего воспаления [18] и искажению клинической картины [19].
Из неорганических веществ наиболее часто применят тальк, равномерно рассеивая его по поверхности брюшины экспериментальных животных [12]. Также используют внутрибрюшинное введение диметилсульфоксида (ДМСО). Модели, основанные на введении ДМСО, обладающего слабым противовоспалительным действием, характеризуются 10% летальностью на фоне достаточно низкой частоты появления спаек (до 60%), и поздних сроков их формирования (до 25 суток) [20]. Из органических веществ для инициации спайкообразования используют внутрибрюшинное введение 2,5 % раствора глютарового альдегида [21], что приводит к быстрому, на 7 сутки, формированию спаек, или 2%-ого раствора хитозана [9, 22]. Во всех описанных случаях необходимо учитывать, что буферные свойства интраперитонеальной жидкости у грызунов могут оказаться не способными нейтрализовать возможную кислотность материала, так как вводимое в эксперименте количество в весовом соотношении, может превышать применяемое у человека в 50-70 раз. Подобный эффект был описан в экспериментах с Interceed barrier, который, будучи эффективным у людей [23], повреждал ткани и даже усиливал процессы спайкообразования в экспериментах на мышах [24].
Часть исследователей, стараясь приблизить экспериментальную модель к клинике, моделирует процессы спайкообразования после инфекции и на фоне перитонита путем введения биологических объектов (микробов) [5]: в брюшную полость животных может вводиться стандартная микробная взвесь, состоящая из равного количества E.coli и B.fragilis или заливаться гнойный экссудат [12, 25].
В последнее же время, на первый план выходят достаточно простые, но обладающие высокой повторяемостью, модифицированные варианты классической техники создания «ишемических пуговиц». Подобные техники позволяет моделировать несколько (до 8) участков на одном животном, сравнительно просты и характеризуются высокой степенью повторяемости [7, 26].
Наконец, в литературе описан метод моделирования спаек ex vivo, с помощью которого впервые были продемонстрированы ранние этапы формирования спаек [27]. Данный метод включает в себя формирование полосок брюшины, которых затем выращивают на питательной среде, сгибая и помещая между ними кровяной сгусток для формирования спаек [27].
Преимущества и недостатки применяемых
методов моделирования
Основные преимущества методик, основанных на однократной травматизации брюшины, заключаются в простоте выполнения, наличии четкой локализаций места инициирования процесса спайкообразования и достаточно высокой частоты последнего [5]. В качестве недостатков можно отметить отсутствие стандартизированного подхода в моделировании, вследствие чего варьирует глубина и размер повреждения брюшины [5], хотя ситуацию можно улучшить за счет использования трафаретов и устройств, задающих площадь повреждения [3, 28].
Несмотря на то, что по сравнению с непосредственной однократной травматизацией брюшины, комбинированные модели приводят к более высокой частоте образования спаек, и даже развитию спаечной болезни, к их недостаткам можно отнести различную выраженность спаечного процесса у животных [8] и большую летальность.
К недостаткам способа, основанного на введении хитозана, относят сравнительно большой объем введенного гелеобразного хитозана в брюшную полость, что приводит к повышению внутрибрюшного давления [9], к достоинствам— постулируемое отсутствие летальности и травматизации животных [22]. В свою очередь, модели, при которых спайкообразование инициируется за счет введения микробной взвеси в брюшную полость животных [5, 12, 13], также характеризуются высокой смертностью животных, появлением большого количества постоперационных осложнений и невозможностью выполнения подобных манипуляций в учреждениях, не сертифицированных для работы с микроорганизмами.
К плюсам моделей, включающих в себя вживление сеток, можно отнести хорошую клиническую релевантность, высокую повторяемость результатов и примерно равные объёмы поражения, задаваемые размером применяемой сетки.
Несмотря на простоту выполнения вариантов техники создания «ишемических пуговиц», ишемическое повреждение, вследствие действия медиаторов воспаления, вызывает повреждение и развитие спаек не только в точке приложения, но и на отдаленных участках [29], что может приводить к неправильной интерпретации результатов исследований.
К преимуществам методов ex vivo можно отнести как снижение требуемого числа лабораторных животных (от одного животного можно получить несколько полосок), так и хорошую визуализацию результатов на всех временных периодах, в то время как к недостаткам—требования к квалификации исполнителей, способных работать с культурами клеток и тканей [27].
Заключение
Все модели спайкообразования основаны на индукции воспалительного процесса повреждением [3, 30]. При этом, тип наносимого повреждения, вследствие которого инициируются процессы спайкообразования, не является принципиальным при изучении патогенеза спайкообразования: даже формирование пневмоперитонеума при лапароскопических операциях может приводить к появлению спаек [3, 30]. Так, известно, что даже формирование повышенного давления внутри брюшной полости (пневмоперитонеума) при лапароскопических операциях может приводить к появлению спаек, количество которых напрямую зависит от длительности пневмоперитонеума, состава газовой смеси, ее давления и температуры [3, 30]. Пусковым фактором развития воспалительного процесса в данном случае является ишемия вследствие тампонады мелких сосудов [30, 31], что сопровождается снижением парциального давления O2 в брюшине. В последующем, существенную роль играет выделение активных формы кислорода (reactive oxygen species, ROS) в участках ишемического повреждения: количество спаек существенно снижается при действии акцепторов ROS или антиоксидантов, и температуры подаваемой газовой смеси—понижение температуры ведет к снижению спайкообразования, так как тормозит воспалительный ответ [31]. Также, лапаротомия/торакотомия, даже если не сопровождается никакими добавочными манипуляциями (часто используется в экспериментальных работах у животных группы сравнения—ложнооперированных) приводит к формированию спаек [32, 33]; спайкообразование в брюшной полости может быть обнаружено практически в 100% оперативных вмешательств [34].
В целом же, несмотря на принципиальную схожесть описанных в литературе моделей, их многообразие позволяет выбрать наиболее соответствующую поставленным экспериментатором целям. Так, при проведении скрининговых исследований и поиске медикаментозных средств системного действия наиболее перспективными являются простые модели, основанные на травматизации брюшины путем наложения швов, которые не требуют больших трудозатрат и высокой квалификации исполнителя. В то же время, при изучении особенности протекания спаечной болезни наиболее перспективными являются хирургические методы с выведением органокомплексов в рану, наполнением брюшной полости инертными наполнителями или повреждением брюшины тонкого кишечника; в то время как оценка клинических эффектов от вживления инородных тел (например, при пластике грыж) требует использования релевантных техник. В свою очередь, в тех случаях, когда в задачах работы стоит оценка динамики спайкобразования под действием тех или иных агентов (в том числе и местного действия), модернизированные техники создания «ишемических пуговиц» выходят на первый план.
Вследствие вышесказанного, можно утверждать, что единственный способ лечения спаечной болезни—это оперативный, так как спайки представляют собой сформированный (конечный) продукт развития воспалительного процесса. Терапевтические подходы к лечению спаечной болезни, в свою очередь, могут быть направлены только на 1) предотвращение развития спайкообразования и 2) замедление данных процессов, что, однако, нисколько не снижает актуальность и востребованность их разработки.

About the authors

Boris Yushkov

Institute of Immunology and Physiology of RAS

Email: b.yushkov@iip.uran.ru
ORCID iD: 0000-0001-8780-9889
SPIN-code: 9333-4503
Scopus Author ID: 6701802851
ResearcherId: N-3964-2019

member of RAS, professor, MD, head of the laboratory of immunophysiology and immunopharmacology

Russian Federation, 106 Pervomayskaya str., Ekaterinburg, Russia. 620219

Alexey Sarapultsev

Institute of Immunology and Physiology of RAS

Author for correspondence.
Email: a.sarapultsev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3101-9655
SPIN-code: 7212-5394
Scopus Author ID: 54917576700
ResearcherId: K-7220-2012

MD, PHD, senior researcher, laboratory of immunopathophysiology

Russian Federation, 106 Pervomayskaya str., Ekaterinburg, Russia. 620219

German Sarapultsev

Institute of Immunology and Physiology of RAS

Email: dr.sarapultsev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2297-2295
SPIN-code: 9104-3726

junior researcher, laboratory of immunopathophysiology

Russian Federation, 106 Pervomayskaya str., Ekaterinburg, Russia. 620219

References

Supplementary files