Intraoperative Options to Stimulate the Reparative Liver Regeneration in the Experiment

Full Text

Первичными и вторичными злокачественными новообразованиями, травмами печени страдают более 500 млн. человек в мире, из которых один миллион умирает ежегодно [1, 2].  Около 700 тыс. летальных исходов в год приходится на долю гепатоцеллюлярной карциномы и, согласно данным ВОЗ, отмечается тенденция к росту данного показателя [3, 4]. Вторичные злокачественные новообразования печени встречаются у каждого четвертого онкологического пациента, при этом 60% из них показано выполнение резекции печени [5, 6, 7]. Операции на печени остаются травматичными и технически сложными вмешательствами, что обусловлено обширным повреждением печеночной ткани с выраженной реакцией организма, а также возможностью развития тяжелых интра- и послеоперационных осложнений в 6–36% случаев [5, 7]. В связи с особенностями анатомического расположения печени, сложностью обеспечения полноценного лапароскопического доступа к отдельным ее сегментам, основой хирургической гепатологии продолжают оставаться открытые вмешательства [8, 9].  
Пострезекционная печеночная недостаточность, по данным литературы, встречается в 32–60% наблюдений и риск ее развития связан с несколькими факторами [1-4]. Прежде всего, это дисфункция оставшегося объема паренхимы печени, обусловленная исходными дистрофическими или цирротическими изменениями; гипоксия, которая может носить циркуляторный, гемический или смешанный характер [10, 11]. 
В целях профилактики и лечения печеночной недостаточности в пред- и послеоперационной инфузионной терапии широко применяют различные гепатопротекторные препараты, в частности адеметионин, а также витамины, в состав которых входит, в том числе, цианокобаламин [11, 12]. Однако, на сегодняшний день, существующие способы профилактики печеночной дисфункции, позволяющие активировать пролиферацию гепатоцитов в раннем послеоперационном периоде, зачастую обладают недостаточной эффективностью [13, 14, 15].
Таким образом, на современном этапе развития медицины, поиск новых методов стимуляции репаративной регенерации печени остается актуальной задачей хирургии, решение которой может способствовать сокращению сроков восстановления печеночной ткани, снижению риска развития послеоперационной печеночной недостаточности.
Цель
Стимуляция пострезекционной регенерации печени интраоперационными внутрипеченочным и внутрибрюшинным введениями цианокобаламина и адеметионина в эксперименте.
Материалы и методы 
Работа представляет собой проспективное рандомизированное исследование, выполненное на базе Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России.
Эксперименты выполнены на 192 половозрелых самцах крыс линии Wistar, которым выполняли типичную резекцию печени (ТРП) ~ 70% исходного объема печени. Исследование проведено в трех блоках, 8 группах – 5 контрольных, 3 опытных (табл. 1). Во всех группах осуществляли типичную 
резекцию ~ 70% объема печени, согласно модели предложенной G. Higgins и R. Anderson [16]. Операцию выполняли под внутримышечным наркозом с помощью препарата «Золетил-100» в дозе 8 мкг/кг в асептических условиях. В качестве хирургического доступа использовали верхнюю срединную лапаротомию. Мобилизацию удаляемых долей - двух левых и медиальной, осуществляли пересечением венозной связки. Мобилизованную долю печени выводили в рану, обеспечивая визуализацию сосудистой ножки. Проксимальный участок выделенной сосудистой ножки перевязывали прошивной лигатурой, дистальный участок – перевязывали.  Две левые и медиальную доли печени отсекали выше уровня наложенной прошивной лигатуры. Осуществляли контроль гемостаза. Операционную рану ушивали послойно: мышцы простым обвивным швом, кожу – узловыми. В качестве шовного материала на всех этапах использовали полигидроксиацетиловую нить 4/0.
При проведении эксперимента для стимуляции репаративной регенерации печени применяли растворы цианокобаламина (конц. 500 мкг/мл), адеметионина (конц. 400 мг/мл). В I блоке исследования изучали влияние внутрибрюшинного введения адеметионина и цианокобаламина на пострезекционную регенерацию печени. В 1-й контрольной группе стимуляцию пролиферации гепатоцитов не осуществляли; во 2-й контрольной – после резекции печени вводили адеметионин внутрибрюшинно в объеме 1 мл; в опытной – цианокобаламин 1 мл. Во II блоке исследования изучали влияние интраоперационных внутрипеченочных инъекций и внутрипеченочного введения препаратов на пострезекционную регенерацию печени. В 1-й контрольной группе в сохраненные доли печени интраоперационно внутрипеченочно вводили 0,9% раствор хлорида натрия в объеме 1 мл; во 2-й контрольной – адеметионин; в опытной - цианокобаламин. В III блоке исследования изучали комбинированное применение адеметионина и цианокобаламина и их влияние на пострезекционную регенерацию печени. В контрольной группе адеметионин (0,5 мл) и цианокобаламин (0,5 мл) вводили внутрибрюшинно, в опытной - внутрипеченочное введение цианокобаламина (0,5 мл) дополняли внутрибрюшинным введением адеметионина (0,5 мл). Животных выводили из эксперимента на 1-е, 5-е, 7-е и 14-е сутки после резекции печени, выполняли гепатэктомию, проводили забор крови и материала для исследования.
Для оценки репаративных процессов применяли объективные и лабораторные методы исследования: оценку общего состояния, динамики массы печени, синдромов цитолиза, холестаза, печеночно-клеточной недостаточности, анализ липидного профиля, оксидативного стресса, оценку экспрессии первичных и вторичных митогенов - факторов роста интерлейкин – 1β (IL-1β)  и трансформирующий ростовой фактор - β1 (TGF- β1).
Для математической и статистической обработки данных был использован пакет программ STATGRAPHICS Centurion 18, версия 18.1.12 (Statgraphics Technologies, Inc., США). В работе для сравнения средних значений по 8 различным группам использовался дисперсионный анализ (ANOVA). В качестве основного инструмента дисперсионного анализа применялся F-тест, который рассчитывался как отношение межгрупповой дисперсии к внутригрупповой дисперсии, и показывал, насколько значимы различия между группами. Для определения статистической значимости различий между дисперсиями использовали таблицу распределения Фишера-Снедекора. Определяли значение критической F-статистики для выбранных уровней значимости (p = 0,05) и степеней свободы.
Результаты и их обсуждение
I блок исследования 
В I блоке исследования наиболее быстрая нормализация общего состояния наблюдалась при внутрибрюшинном введении адеметионина (2-я контрольная группа) - у 77,8% животных на 5-е сутки после резекции печени, что превышало показатели 1-й контрольной группы на 27,8%, опытной – на 5,6%. Однако, наибольший процент восстановления исходной массы печени был зарегистрирован при внутрибрюшинном введении цианокобаламина (опытная группа) – у 85,26%, что превышало показатели 1-й контрольной группы на 9,61%, 2-й контрольной – на 3,46% (табл. 2).  При этом, следует отметить, что различия между 2-й контрольной и опытной группами были статистически недостоверны.
При изучении динамики цитолитического синдрома наибольшие отклонения аланинаминотрансферазы (АЛТ) на 1-е сутки были зарегистрированы в 1-й контрольной группе, во 2-й контрольной показатель АЛТ был ниже на 15,26%, в опытной – на 11,21%. Различия по показателю аспартатаминотрансфераза (АСТ) были статистически недостоверны. На 5-е сутки во 2-й контрольной группе АЛТ был ниже на 12,91%, АСТ – на 22,82% в сравнении с 1-й контрольной группой, в опытной – на 11,11% и 23,96%, соответственно. На 7-е сутки сохранялась сходная динамика. К 14-м суткам отмечалась нормализация показателей у всех животных только во 2-й контрольной группе. 
Максимальные показатели холестатического синдрома были зарегистрированы на 1-е сутки после резекции печени: щелочная фосфатаза (ЩФ), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП) и общий холестерин (ОХ) – в 1-й контрольной группе, общий билирубин (БЛ) – во 2-й контрольной и опытной группах. На 5-е и 7-е сутки статистически значимых различий между группами выявлено не было. На 14-е сутки после операции наблюдалась нормализация БЛ только в опытной группе, ГГТП и ОХ – только во 2-й контрольной группе. Нормализации ЩФ в группах исследования зарегистрировано не было.  
При оценке показателей синдрома печеночно-клеточной недостаточности наблюдалось значительное снижение белково-синтетической функции печени и нарушение углеводного и азотистого обменов у всех животных. Общий белок (ОБ) был значительно снижен во всех группах, нормализации данного показателя к 14-м суткам не отмечали, наилучший показатель был зарегистрирован во 2-й контрольной группе - на 12,75% ниже нормы. У всех животных с 1-х по 14-е сутки наблюдалось повышение уровня глюкозы (ГЛ) крови, нормализации данного показателя зарегистрировано не было, наименьшее значение отмечали также во 2-й контрольной группе. При оценке показателей азотистого обмена нормализация уровня креатинина (КР) была зарегистрирована на 14-е сутки эксперимента у всех животных, уровень мочевины (МЧ) в крови приходил к норме только в опытной группе. 
При анализе липидного профиля можно отметить нарушение жирового обмена с 1-х по 7-е сутки после резекции печени, при этом статистически значимые различия наблюдались только на 1-е сутки при сравнении опытной и 1-й контрольной групп. К 14-м суткам эксперимента показатели нормализовались у всех животных. 
При оценке активности системы антиоксидантной защиты и динамики продуктов окисления (малоновый диальдегид (МДА) и 1,2-дифенилгидразин (ДНФГ)) наибольшая активность ферментативной системы защиты (глутатионпероксидаза (ГП), глутатионредуктаза (ГР) и супероксиддисмутаза (СОД)) отмечалась на 5-е и 7-е сутки после резекции печени, максимальные показатели во 2-й контрольной группе, при этом наблюдали значительное снижение ДНФГ во 2-й контрольной группе на 7-е сутки в сравнении с 1-й контрольной группой. 
При оценке динамики факторов роста максимальные показатели IL-1β наблюдались на 5-е сутки после резекции печени при внутрибрюшинном введении цианокобаламина.  Наибольшее значение TGF-β1 было зарегистрировано на 7-е сутки, также в опытной группе, однако статистически значимых различий по данному показателю между группами в указанный срок отмечено не было (табл. 3).
II блок исследования
Во II блоке исследования наиболее быстрая нормализация общего состояния наблюдалась при внутрипеченочном введении цианокобаламина (опытная группа) - у 100% животных на 5-е сутки после резекции печени, что превышало показатели 1-й контрольной группы на 83,33%, 2-й контрольной – на 94,44%. Следует отметить, что к 14-м суткам в контрольных группах у 16,67% животных нормализации общего состояния не отмечали. 
При оценке восстановления исходной массы печени к 14-м суткам наилучшие показатели наблюдались в опытной группе - 95,27%, что превышало показатели 1-й контрольной группы на 13,40%, 2-й контрольной – на 25,98% (табл. 4).
При изучении динамики показателей цитолитического синдрома наибольшие показатели цитолиза были зарегистрированы при внутрипеченочном введении адеметионина (2-я контрольная группа) на 5-е сутки, что превышало показатели 1-й контрольной в 1,3 и 2,9 раза, соответственно. Нормализация АСТ и АЛТ отмечалась только в опытной группе на 7-е сутки после резекции печени. К 14-м суткам сохранялась сходная динамика. 
Максимальные показатели холестатического синдрома после резекции печени были зарегистрированы во 2-й контрольной группе: ЩФ – на 1-е сутки, БЛ и ГГТП – на 5-е сутки. Нормализации показателей к 14-м суткам в контрольных группах не отмечали. В опытной группе на 7-е сутки после операции отмечали нормализацию ЩФ, ГГТП и ОХ. 
При оценке показателей синдрома печеночно-клеточной недостаточности наблюдалось значительное снижение белково-синтетической функции печени и нарушение углеводного и азотистого обменов у всех животных после ее резекции. В опытной группе на 7-е сутки отмечали нормализацию уровней ГЛ, КР и МЧ. В 1-й контрольной группе наблюдалась нормализация показателей азотистого обмена, однако уровень глюкозы был повышен. Во 2-й контрольной группе все определяемые показатели синдрома печеночно-клеточной недостаточности имели выраженные отклонения. Общий белок был также снижен во всех группах, нормализации данного показателя к 14-м суткам не отмечали, наилучший показатель был зарегистрирован в опытной группе - на 8,09% ниже нормы. 
При анализе липидного профиля было установлено, что нормализация более чем 50% показателей наблюдалась только в опытной группе. Наибольший дисбаланс жирового обмена наблюдался во 2-й контрольной группе. 
При оценке активности системы антиоксидантной защиты и динамики изменения уровня продуктов окисления наибольшая активность ферментативной системы защиты отмечалась на 5-е и 7-е сутки после резекции печени, максимальные показатели зарегистрированы в опытной группе, при этом наблюдали значительное снижение продуктов окисления.  В большей степени окислительный стресс был выражен при внутрипеченочном введении адеметионина, что подтверждалось накоплением продуктов окисления, при этом активность систем защиты была значительно снижена. 
Оценка динамики показателей экспрессии факторов роста демонстрировала значительное повышение показателей IL-1β и TGF- β1 в опытной группе - более чем в 2 раза в сравнении с 1-й контрольной группой. Во 2-й контрольной группе отмечалось снижение концентрации первичных и вторичных митогенов (табл. 5).
III блок исследования 
В III блоке исследования наиболее быстрая нормализация общего состояния наблюдалась при внутрипеченочном введении цианокобаламина, дополненном внутрибрюшинным введением адеметионина (опытная группа) - у 100% животных на 5-е сутки после резекции печени, что превышало показатели контрольной группы на 22,22%. При оценке восстановления исходной массы печени к 14-м суткам наилучшие показатели наблюдались также в опытной группе - 95,04%, что превышало показатели контрольной группы на 8,67% (табл. 6).
При изучении динамики показателей цитолитического синдрома наибольшие показатели цитолиза были зарегистрированы в контрольной группе на 1-е сутки после резекции печени. Нормализация показателей отмечалась в опытной группе на 7-е сутки. На 14-е сутки в контрольной группе АЛТ приходил к норме, а АСТ превышал нормальные значения на 1,04%. 
Нормальные показатели холестатического синдрома после резекции печени были зарегистрированы только в опытной группе: ЩФ, ГГТП, ОХ – на 7-е сутки, БЛ - на 14-е сутки. Нормализации показателей к 14-м суткам в контрольной группе не отмечали, за исключением ОХ. 
При оценке показателей синдрома печеночно-клеточной недостаточности наблюдалось снижение белково-синтетической функции печени и нарушение углеводного и азотистого обменов у всех животных после ее резекции. В опытной группе на 7-е сутки отмечали нормализацию ГЛ и МЧ, на 14-е – ОБ и КР, в контрольной группе только МЧ и КР на 14-е сутки после операции.  
При анализе липидного профиля нормализация более чем 50% показателей наблюдалась только в опытной группе к 7-м суткам после резекции печени, в контрольной группе только липопротеины очень низкой плотности приходили к нормальным значениям. 
При оценке активности систем антиоксидантной защиты, динамики продуктов окисления, наибольшая активность ферментативной и не ферментативной систем защиты отмечалась на 5-е сутки после резекции печени в опытной группе, что привело к значительному снижению количества продуктов окисления. На 14-е сутки эксперимента МДА и ДНФГ в опытной группе были ниже на 33,28% и 71,43%, в сравнении с контрольной группой.
При оценке динамики показателей экспрессии факторов роста отмечали повышение IL-1β и TGF- β1 в опытной группе - на 5-е сутки показатели IL-1β и TGF- β1 превышали значения контрольной группы на 20,00% и 27,23%, на 7-е сутки - на 108,45% и 31,52%, соответственно (табл. 7).
Выводы
Внутрибрюшинное введение адеметионина способствует нормализации общего состояния, биохимических показателей у 77,78% животных, купированию окислительного стресса, восстановлению 75,70% от исходной массы печени к 14-м суткам, не оказывает значимого влияния на динамику факторов роста. Внутрибрюшинное введение цианокобаламина обеспечивает повышение экспрессии факторов роста IL-1β и TGF- β1, приводит к восстановлению 85,26% от исходной массы печени на 14-е сутки после резекции в сравнении с 1-й контрольной группой (p<0,05), не оказывает значительного влияния на биохимические показатели, в т.ч. окислительный стресс.
Внутрипеченочное введение цианокобаламина приводит к снижению показателей синдромов цитолиза и холестаза, восстановлению углеводного и жирового обменов, повышению экспрессии факторов роста, приводит к восстановлению до 95,27% от исходной массы печени к 14-м суткам после резекции в сравнении с 1-й контрольной группой (p<0,05). Внутрипеченочное введение адеметионина приводит к значительным нарушениям функции печени, снижению защитных антиоксидантных свойств, скорости восстановления печеночной ткани, показателей IL-1β и TGF- β1, в сравнении с 1-й контрольной группой (p<0,05).
Наиболее эффективным является внутрипеченочное введение цианокобаламина дополненное внутрибрюшинным введением адеметионина, которое на 7-е сутки после резекции печени способствует нормализации биохимических показателей, купированию окислительного стресса, повышению ИЛ-1β на 108,45% и TGF- β1 на 31,23%, приводит к восстановлению 95,04% от исходной массы печени к 14 суткам после резекции, в сравнении с контрольной группой (p<0,05).

About the authors

Anastasiya Yurievna Laptiyova

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

Email: laptievaa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3307-1425
SPIN-code: 7626-9016

Assistant of the Department of General and Outpatient Surgery

Russian Federation, 394036, Russia, Voronezh, 10 Studentskaya str.

Alexander Alexeyevich Andreev

N.N. Burdenko Voronezh State Medical University

Email: sugery@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8215-7519
SPIN-code: 1394-5147

MD, Professor of the Department of General and Outpatient Surgery

Russian Federation, 394036, Russia, Voronezh, 10 Studentskaya str

Alexander Anatolievich Glukhov

Voronezh N.N. Burdenko State Medical University

Email: glukhov-vrn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9675-7611

M.D., Professor, head of the Department of General and Outpatient Surgery

Russian Federation, 10 Studencheskaya str. Voronezh, 394036, Russia

Viktoria Viktorovna Shishkina

N.N. Burdenko Voronezh State Medical University; Research Institute of Experimental Biology and Medicine

Email: v.v.4128069@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9185-4578
SPIN-code: 9339-7794

Ph.D., Associate Professor of the Department of Histology; Director

Russian Federation, 10 Studencheskaya str. Voronezh, 394036, Russia; 185 Moskovsky Prospekt, Voronezh, 394066, Russian Federation

Anton Petrovich Ostroushko

Voronezh N.N. Burdenko State Medical University

Email: anton@vrngmu.com
ORCID iD: 0000-0003-3656-5954

Ph.D., associate Professor of the Department of General and Outpatient Surgery

Russian Federation, 10 Studencheskaya str. Voronezh, 394036, Russia

Lybov Nikolaevna Antakova

Research Institute of Experimental Biology and Medicine

Author for correspondence.
Email: tsvn@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-5212-1005
SPIN-code: 3936-3381

Ph.D., Senior Researcher 

Russian Federation, 185 Moskovsky Prospekt, Voronezh, 394066, Russian Federation

References

Supplementary files