Study of Hematopoietic Stem Cells in Patients with Extensive Burns

Full Text

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) относительно малочисленны, их содержание в костном мозге колеблется в районе  0.01-0.15% от всех ядерных клеток. В первую очередь ГСК отвечают за пополнение всех клеточных компонентов крови, в том числе лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов, а также являются одним из центральных компонентов регенерации тканей [1, 2, 3]. ГСК способны к мобилизации из костного мозга в кровоток после различных травм, в том числе после инфаркта миокарда, инсульта, поражения печени и ожогов кожи [4, 5, 6]. То, что ГСК обладают специфическим хоумингом в поврежденные ткани, в том числе обожженные, способствуют восстановлению и регенерации тканей через паракринные эффекты или прямую дифференцировку, являются центральным компонентом восстановления послеожоговой анемии и способны образовывать не только клетки крови, но и другие типы клеток, анализ этих клеток при ожогах представляется крайне важным в плане изучения новых механизмов патогенеза ожоговой болезни и оценки регенераторного потенциала у тяжелообожженных, тем более, что в предварительных исследованиях нам удалось установить их количественную модификацию при ожогах [7].

В периферической крови ГСК выделяют из общей массы на основе экспрессии определенных антигенов на поверхности клетки с использованием моноклональных антител против панлейкоцитарного антигена CD45 и маркера ранних клеток-предшественников CD34. Антиген CD34 - является общепризнанным маркером стволовых клеток крови человека и представляет собой мембранный белок, молекулу межклеточной адгезии, играющую роль на ранних этапах кроветворения [8]. Кроме того, предполагается  роль белка CD34 в участии мобилизации гемопоэтических клеток, предотвращении активации интегринов, содействии пролиферации гемопоэтических клеток-предшественников и адгезии лимфоцитов к эндотелию сосудов с помощью связывания с L-селектином, дополняя и улучшая клеточную адгезию в целом [9]. В кроветворной ткани существуют пути взаимного превращения CD34^- клеток в CD34⁺. При этом обе фракции могут поступать как в периферическую кровь из костного мозга, так и мигрировать обратно [10, 11].

Для анализа ГСК используют также антитела против активационного антигена CD38, в том числе в комбинации с комплексными антителами к фенотипам. CD38 - мультифункциональный мембранный поверхностный гликопротеин, который экспрессируется различными клетками на определенных этапах их развития. Кроме того, определена его роль в процессе адгезии лимфоцитов к эндотелию сосудов. В качестве трансмембранного рецептора CD38 может передавать как положительные, так и отрицательные сигналы, регулирующие пролиферацию и дифференцировку Т- и В –лимфоцитов [7]. Внеклеточная часть молекулы CD38 функционирует как фермент, который катализирует синтез и гидролиз циклической АДФ-рибозы, которая недавно была идентифицирована как мощный Са2⁺ мобилизирующий агент. Ферментные функции CD38, вероятно, имеют иммунорегуляторное значение. Молодые стволовые кроветворные клетки человека не имеют кластера дифференцировки CD38, в то время как зрелые клеточные формы его уже содержат. В качестве основного фенотипа ГСК человека рассматривается комбинация CD45^dimCD34⁺CD38^- [12]. Помимо «классических» маркеров ГСК в последние годы возрастает интерес к исследованию новых антигенов. На поверхности ГСК человека установлено наличие нового кластера дифференцировки CD133, который экспрессируется на большинстве CD34⁺ клеток и не определяется уже на поздних прогениторных кроветворных клетках [13].

Цель

Исследование в динамике содержания гемопоэтических стволовых клеток разных фенотипов у пациентов с обширными ожогами в процессе комплексного лечения.

Материалы и методы

Исследование гемопоэтических стволовых клеток разных фенотипов выполнено у 25 пациентов с обширными ожогами двукратно: при поступлении в Ожоговый центр НМИЦ хирургии им А.В. Вишневского (на 1-15 сутки после травмы) и через 20 дней комплексного лечения. Специализированное комплексное лечение пациентам проводилось в палате интенсивной терапии и в палате ожогового отделения с применением противоожоговых (флюидизирующих) кроватей, включающее круглосуточное мониторирование гемодинамики и волемического статуса, осуществлялась лабораторная и инструментальная диагностика и лечение осложнений ожоговой болезни, нутритивная поддержка. По показаниям - респираторная поддержка с применением аппаратов искусственной вентиляции легких, экстракорпоральное воздействие на кровь с применением аппаратов ультрагемофильтрации и плазмафереза,  местное медикаментозное лечение ожоговых ран с использованием современных раневых покрытий, хирургическая некрэктомия и кожная пластика для закрытия ран. Площадь ожогового поражения на этапе поступления пациентов составила 44,0±4,7 % поверхности тела (п.т.), возраст больных 42,4 ± 4,7 года.  В группу сравнения включили 15 здоровых добровольцев в возрасте  33,9±4,7 лет с целью  определения референсных показателей субпопуляций ГСК для последующего сравнительного анализа их содержания у пациентов. По гендерным показателям и возрасту группы достоверно не различались (р = 0,22).

Образцы периферической венозной крови собирали в пробирки с ЭДТА в количестве 2,7 мл. В работе были использованы моноклональные антитела CD45 PerCP-Cy5.5 (клон HI30, BD Biosciences, США), CD34 FITC (клон 581, BD Biosciences, США), CD38 РЕ (клон HIT2, BD Biosciences, США), CD133/1(AC133) PE (клон AC133, Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Для анализа субпопуляций ГСК использовали трехцветные панели CD45/CD34/CD38 и CD45/CD34/CD133, для чего смешивали по 5 мкл соответствующих моноклональных антител и 100 мкл цельной крови с экспозицией 20 минут при 4° С, далее добавляли 1000 мкл лизирующего раствора BD FACS Lysing solution (BD Biosciences, США) и после лизиса эритроцитов выполняли фенотипирование субпопуляций ГСК в подготовленных пробах на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CellQuest. При подсчете собирали не менее 5×10⁵ клеток, пересчет ГСК проводили в % от числа клеток лимфоцитарного полигона. Статистический анализ выполняли с помощью программы GraphPad Prism 7.0 (США). Данные приведены в виде медиана ± стандартная ошибка (Mean±SEM), статистическая значимость рассчитана по критерию Манна - Уитни при p < 0,05.    

Результаты

При исследовании циркулирующих ГСК у здоровых лиц определены средние количественные показатели в % различных популяций стволовых клеток крови  (табл. 1) для последующего сравнительного анализа содержания ГСК у больных с обширными ожогами на разных этапах комплексного лечения. 

Таблица 1. Содержание популяций ГСК у здоровых добровольцев

Популяции ГСК	Здоровые добровольцы (n=15),%
CD45+34+	0,048±0,005
CD45dim34+38-	0,031± 0,003
CD45dim34+38+	0,017±0,003
CD45dim34+133 -	0,017±0,003
CD45dim34+133+	0,032±0,004

 

Table 1. Content of HSC populations in healthy volunteers

HSC populations	Healthy volunteers (n=15),%
CD45+34+	0,048±0,005
CD45dim34+38-	0,031± 0,003
CD45dim34+38+	0,017±0,003
CD45dim34+133 -	0,017±0,003
CD45dim34+133+	0,032±0,004

 

У исследуемой группы тяжелообожженных пациентов в сравнении с группой здоровых добровольцев при поступлении в Ожоговый центр выявлен достоверный  глубокий дефицит в периферической крови общих гемопоэтических клеток  CD45⁺34⁺ (0,022±0,003 %, р=0,0002), который восстановился в процессе лечения (0,05± 0,012 %, р=0,0307) (рис. 1).

Рис. 1. Динамика относительного количества общих ГСК CD45⁺34⁺  в крови  пациентов с ожогами в процессе комплексного лечения

Figure. 1. The dynamics of the relative amount of the total HSC CD45⁺ 34⁺ in the blood of patients with burns in the process of complex treatment

На гистограммах приведены примеры визуальной оценки содержания ГСК у пациентов с нормальным уровнем ГСК (рис.2) и при их фактически полном отсутствии (рис. 3).

Рис. 2. Пример гистограммы с нормальным содержанием общих ГСК (CD45⁺34⁺)

Fig. 2. An example of a histogram with the normal content of the general HSC (CD45⁺34⁺)

Рис. 3. Пример гистограммы с дефицитом содержания общих ГСК (СD45⁺34⁺)

Fig. 3. An example of a histogram with a deficiency of general HSC (CD45⁺34⁺)

 

Надо отметить, что восстановление уровня общих ГСК происходило быстрее у пациентов, которым удалось провести этапное хирургическое лечение ожоговых ран в более ранние сроки ожоговой болезни при отсутствии гнойно-септических осложнений.

При изучении содержания у тяжелообоженных пациентов различных субпопуляций ГСК, отражающих в том числе  репаративные процессы в очагах ожогового поражения, при поступлении также выявлен дефицит CD45^dim34⁺38⁺ клеток (р=0,0188), причем преимущественно основного фенотипа ГСК CD45^dim34⁺38^- (р=0,0001) и ранних предшественников гемопоэза CD45^dim34⁺133⁺ (р=0,0002) (табл. 2), что может свидетельствовать о подавлении компенсаторно-приспособительных реакций гемопоэза на этапах поступления больных в тяжелом клиническом состоянии, когда еще не применен весь необходимый комплекс лечебных мероприятий, направленных в первую очередь на компенсацию и протекцию жизненно-важных функций и внутренних констант организма, коррекцию интоксикационного синдрома, профилактику инвазивной раневой инфекции, в т.ч. методы хирургического воздействия на первичные очаги ожогового поражения.

В процессе комплексного лечения на 20-е сутки у больных с тяжелыми ожогами отмечается достоверное повышение (до уровня здоровых лиц) основной субпопуляции ГСК CD45^dim34⁺38^- (0,039± 0,009%,  р=0,0155). При этом дефицит популяций CD45^dim34+38+ и CD45^dim34⁺133⁺ восстановился не полностью (табл. 2).

Таблица 2. Содержание субпопуляций ГСК у здоровых лиц и пациентов с ожогами в динамике

 

Популяции ГСК	Здоровые добровольцы (n=15)	Пациенты с ожогами (n=25)
		при поступлении Mean±SEM	Р	на 20 сутки лечения Mean±SEM	Р
CD45dim34+38- %	0,031± 0,003	0,013±0,002	0,0001#	0,039± 0,009	0,0155*
CD45dim34+38+ %	0,017±0,003	0,007± 0,002	0,0188#	0,012±0,004	0,2721
CD45dim34+133- %	0,017±0,003	0,010± 0,003	0,0785	0,028± 0,008	0,0380*
CD45dim34+133+ %	0,032±0,004	0,011± 0,003	0,0002#	0,020± 0,006	0,1879

 

Обозначения: # -  достоверные различия между группой здоровых добровольцев и ожоговыми пациентами при поступлении; * достоверные различия между группами пациентов  при поступлении и на фоне лечения

 

Table 2. The content of HSC subpopulations in healthy individuals and patients with burns in dynamics

HSC populations	Healthy volunteers (n=15)	Patients with burns (n=25)
		on admission Mean±SEM	Р	on 20 days of treatment Mean±SEM	Р
CD45dim34+38- %	0,031± 0,003	0,013±0,002	0,0001#	0,039± 0,009	0,0155*
CD45dim34+38+ %	0,017±0,003	0,007± 0,002	0,0188#	0,012±0,004	0,2721
CD45dim34+133- %	0,017±0,003	0,010± 0,003	0,0785	0,028± 0,008	0,0380*
CD45dim34+133+ %	0,032±0,004	0,011± 0,003	0,0002#	0,020± 0,006	0,1879

 

Designations: # - reliable differences between a group of healthy volunteers and burn patients upon admission; * reliable differences between groups of patients upon admission and against the background of treatment

В популяции CD45^dim34⁺133^- отмечено достоверное возрастание в процессе лечения этих клеток в сравнении с исходным периодом, когда их уровень не отличался от группы здоровых лиц.

Обсуждение

Выраженный дефицит содержания общих ГСК и их ранних и зрелых субпопуляций может быть обусловлен обширной и тяжелой термической травмой с подавлением регенераторного потенциала этих клеток и возможной усиленной миграцией из периферической крови в область ожоговых ран при поступлении в ожоговый центр, когда еще не начат весь комплекс специализированной хирургической и высокотехнологичной медицинской помощи пострадавшим от ожогов, в целом направленной на восстановление общего гомеостаза и органной дисфункции, снижение эндогенной интоксикации организма и предупреждение инвазивной раневой инфекции, в том числе за счет своевременного этапного хирургического удаления некротизированных тканей и ожогового струпа, для подготовки к аутодермопластике по закрытию ожоговых ран.

Заключение

Результаты показывают, что у пациентов при благоприятном течении ожоговой болезни нивелируется глубокий дефицит ГСК в процессе адекватного комплексного лечения и активируются тканевые регенераторные процессы.  В то же время, у части пациентов с вялыми грануляциями и медленным заживлением ран, лизисом аутодермотрансплантатов мы наблюдали стойкое исчезновение некоторых субпопуляций ГСК, что может обусловливаться истощением пула этих клеток или их токсическим повреждением. Полученные данные могут подтверждать предиктивное использование данных маркеров для прогноза развития осложнений ожоговой болезни и заживления ожогов. Во всяком случае, выявленные модуляции содержания ГСК при ожогах обнаружены впервые, они имеют большое фундаментальное значение и требуют дальнейшего анализа по мере накопления клинического материала и выявления причин такой модуляции.

About the authors

Maria Nikolaevna Kozlova

A.V. Vishnevsky National Medical Research Center of Surgery

Email: mnkozlova@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-0554-7094
SPIN-code: 7631-8050
Scopus Author ID: 57194480001

PhD, Senior Researcher of the Clinical Diagnostic Laboratory

 

Russian Federation, 117997, Russia, Moscow, B. Serpukhovskaya street, 27

Vladimir Mikhailovich Zemskov

A.V. Vishnevsky National Medical Research Center of Surgery, Mosсow, Russia

Email: arturrego@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8867-5349
SPIN-code: 7754-0336
Scopus Author ID: 7103049738

MD, Professor, Chief Researcher of the Clinical Diagnostic Laboratory

Russian Federation, 117997, Russia, Moscow, B. Serpukhovskaya street, 27

Andrey Anatolyevich Alekseev

A.V. Vishnevsky National Medical Research Center of Surgery, Mosсow, Russia;
Federal State Budgetary Educational Institution of Further Professional Education "Russian Medical Academy of Continuous Professional Education" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Mosсow, Russia

Email: alexseev@ixv.ru
ORCID iD: 0000-0001-6675-4794
SPIN-code: 4803-3939
Scopus Author ID: 720289106

MD, Professor, Deputy Director

Russian Federation, 117997, Russia, Moscow, B. Serpukhovskaya street, 27

Valentina Semenova Demidova

A.V. Vishnevsky National Medical Research Center of Surgery, Mosсow, Russia

Email: demidova@ixv.ru
ORCID iD: 0000-0003-3187-4408
SPIN-code: 5611-4653
Scopus Author ID: 56977389500

MD, Head of Clinical Diagnostic Laboratory

Russian Federation, 117997, Russia, Moscow, B. Serpukhovskaya street, 27

Nadezhda Semenovna Shishkina

A.V. Vishnevsky National Medical Research Center of Surgery, Mosсow, Russia

Email: nadya-vesy@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0600-6038
SPIN-code: 9773-1960
Scopus Author ID: 57194481862

Junior Researcher of the Clinical Diagnostic Laboratory

Russian Federation, 117997, Russia, Moscow, B. Serpukhovskaya street, 27

Anna Nikolaevna Kulikova

A.V. Vishnevsky National Medical Research Center of Surgery, Mosсow, Russia

Email: shinshila72@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5514-5600
SPIN-code: 6535-0560

Doctor of Clinical Diagnostic Laboratory

Russian Federation, 117997, Russia, Moscow, B. Serpukhovskaya street, 27

Andrey Mikhailovich Zemskov

N.N. Burdenko Voronezh State Medical University,Voronezh, Russia

Email: zemskov@vsmaburdenko.ru
ORCID iD: 0000-0001-6725-4361

MD, Professor, Head of the Department of Microbiology

Russian Federation, Voronezh, Studentskaya, 10

Alexander Eduardovich Bobrovnikov

A.V. Vishnevsky National Medical Research Center of Surgery, Mosсow, Russia;
Federal State Budgetary Educational Institution of Further Professional Education "Russian Medical Academy of Continuous Professional Education" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Mosсow, Russia

Author for correspondence.
Email: doctorbobr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0926-6115
SPIN-code: 4203-1718
Scopus Author ID: 6602689492

MD, Docent, Head of the burn department

 

Russian Federation, 117997, Russia, Moscow, B. Serpukhovskaya street, 27

References

Supplementary files