"New look" on antioxidant systems in various diabetes mellitus complications

Full Text

Актуальность:

В настоящее время отмечается увеличение числа больных страдающих сахарным диабетом (СД). Рост распространенности сахарного диабета приобрел характер эпидемии в конце XX–XXI веков. В Российской Федерации, по данным Федерального центра Государственного регистра сахарного диабета, на 01.01.2010 г. в РФ зарегистрировано 3 137 182 взрослых больных СД (из них СД 1 – 268 497 человек, СД 2 – 2 868 685 человек). По экспертным оценкам, численность больных СД в мире к 2030 году превысит 380 миллионов человек[3]. Диабетические ангиопатии во многом определяют клиническое течение заболевания, его прогноз и являются основной причиной инвалидизации и смертности в промышленно-развитых странах[4]. Раннее выявление нарушений антиоксидантной системы, которые появляются уже на стадии доклинических проявлений, позволят предотвратить или улучшить течение осложнений связанных с сахарным диабетом[6].

Важную роль в патогенезе диабетической ангиопатии играют как накопление в тканях свободных радикалов, так и функциональная недостаточность антиоксидантных ферментов (каталаза, супероксиддисмутаза) с последующим развитием оксидативного стресса. Доказано, что активация этого процесса, приводящая к значительным расстройствам гомеостаза, может оказаться одной из основных причин неблагоприятного течения сахарного диабета. При неблагоприятных условиях, формируются молекулы, содержащие активные формы кислорода (reactiveoxygenspecies или ROS), которые повреждают липидный слой мембран клеток (lipidperoxydation или LPO)[5].

Защитные способности клетки, определяются мощностью антиоксидантной системы, а восстановленный глутатион (GSH) является одним из наиболее важных  антиоксидантов клеток[7].

Недавние исследования представили убедительные доказательства роли цистеина в синтезе GSH у различных видов животных и человека. Цистеин содержит сульфгидрильную группу (SH), без которой GSH не будет выполнять присущие ему функции[7].

Цистеин (Cys) легко окисляется в цистин (Cys-S-S-Cys) во внеклеточной жидкости. Этот процесс катализируют инсулин и фактор роста, которые усиливают захват цистеина клетками и тем самым увеличивают концентрацию внутриклеточного GSH[8].

Выявленные изменения позволят повысить качество диагностики, оценить степень тяжести СД, а также предложить методы эффективной патогенетической терапии. Впервые для выявления степени истощения антиоксидантной системы у пациентов с различными видами осложнения СД 2типа, были вычислены коэффициенты Cysfree/Cys-S-S-Cys, GSH/GSSG, уровни общего и восстановленного цистеина плазмы и глутатиона в эритроцитах.  Подобная оценка показателей в доступной литературе отсутствует.

Цель исследования

Оценить состояние антиоксидантной системы у пациентов с различными сосудистыми осложнениями СД 2типа, такими как диабетическая ретинопатия (ДР) и ангиопатия сосудов нижних конечностей.

Материалы и методы

В исследовании принимали участие три группы пациентов, всего 75человек в возрасте 55±6,0лет. Мужчин было 43(57,4%), женщин 32(42,6%).  Первая группа пациентов (n=25) включала больных СД 2 типа (инсулиннезависимый) с наличием диабетической ретинопатии. Во второй группе пациентов (n=25), течение СД 2типа (инсулиннезависимый),протекало с развитием ангиопатии сосудов нижних конечностей Длительность заболевания СД 2типа в обеих группах составила ≥5лет. Третью группу составили25 здоровых людей.

Забор крови проводился в вакутайнеры с гепарином. Анализ проводился не позднее 3 часов с момента забора крови.

Определяли уровни общего и свободного глутатиона в эритроцитах, общего и свободного цистеина в плазме, ВЭЖХ методами, разработанными в нашей лаборатории [1, 2] с минимальными модификациями. По результатам рассчитывали соотношения восстановленного и окисленного глутатиона в эритроцитах и восстановленного и окисленного цистеина в плазме.  Проводили вычисление окислительно-восстановительного потенциала плазмы (Cysfree/Cys-S-S-Cys) и коэффициента окислительно-восстановительного состояния клетки (GSH/GSSG) при данных осложнениях СД. Для выполнения исследований мы использовали спектрофотометрический детектор SPD-20A Prominence («Shimadzu», Япония), насос высокого давления LC-20AТ Prominence («Shimadzu», Япония), ручной инжектор 7725i Rheodyne (США) с петлей на 100 мкл, компьютерная хроматографическая программа «Мультихром» версия 3,2 («Амперсанд», Москва). Типичные хроматограммы на рис. 1.

1

2

 

3

 

Рис. 1. Хроматограммы стандартов аминотиолов по 50 нг каждого (1) , экстракта плазмы (2, эквивалент 0.005 мл) и экстракта эритроцитов (3, эквивалент 0.0005 мл). Колонка 100 × 4.6 мм Luna (Phenomenex), C18(2), 5 мкм, около 5000 ТТ, УФ детекция при 330 нм, элюент ацетонитрил – 0.05 М лимонная кислота (15:85, v/v), скорость потока 1000 мкл/мин, давление 68 бар. Обозначения: Cys – цистеин, IS – внутренний стандарт (цистеамин), GSH – глутатион, Hcy – гомоцистеин / Chromatograms standards aminothiols 50 ng of each (1) plasma extract (2, 0.005 ml equivalent) and erythrocyte extract (3, 0.0005 ml equivalent). The column 100 × 4.6 mm Luna (Phenomenex), C18 (2), 5 microns, near 5,000 TT, UV detection at 330 nm, eluent: acetonitrile - 0.05 M citric acid (15:85, v / v), flow rate of 1000 ml/ min, pressure 68 bar. Legend: Cys - cysteine, IS - internal standard (cysteamine), GSH - glutathione, Hcy - homocysteine.

 Для всех расчетов в работе использовали программу «Statistic - 10». Числовые данные приведены в виде среднего (М) и стандартного отклонения (SD). Для статистической обработки использовали критерий Вилкоксона, р-уровень значимости (*)<0,05.

Результаты и обсуждение

В плазме преобладающим аминотиолом является цистин (Cys-S-S-Cys), представляющий собой окисленную форму цистеина (Cys). Коэффициент Cys/Cys-S-S-Cys может служить индикатором антиоксидантного потенциала плазмы, а в целом для оценки его в различных органах и тканях достаточно оценить пул тиолы/дисульфиды [8].

Уровень общего цистеина в группе больных с диабетической ретинопатией составил - 40,2±7,4 мкг/мл, при диабетической ангиопатии нижних конечностей - 31,1±5,1 мкг/мл,  что превышало данный показатель  в контрольной группе на 52% и 23% соответственно. Показатели свободного цистеина  в группе больных с ретинопатией были выше на 47%, а при ангиопатии нижних конечностей ниже на 16% в сравнении со здоровыми лицами. Окисленный цистеин на фоне сахарного диабета, осложненного диабетической ретинопатией повышался в сравнении с контрольной группой в 1,9 раза, а при ангиопатии нижних конечностей в 2,0 раза. Больший интерес представляло изменение коэффициента соотношения Cysfree/Cys-S-S-Cys, который  в группе контроля был 2,1,  при диабетической ретинопатии - 1,65; в группе с диабетической ангиопатией сосудов нижних конечностей  составил всего 0,7.

Полученные данные свидетельствуют о том, что антиоксидантный потенциал плазмы (Cysfree/Cys-S-S-Cys) крови при сосудистых осложнениях СД 2типа уменьшается, в зависимости от стадии процесса. Причем при начальных проявлениях микроангиопатии этот показатель в 2,4 раза больше, чем в группе с более тяжелым осложнением СД 2типа. Данные представлены  в «табл. 1»

Таблица 1

Table 1

 

 

Уровень различных фракций цистеина в плазме / Levels of various fractions of plasma cysteine

Показатели	Контроль	Диабетическая ретинопатия	Диабетическая ангиопатия нижних конечностей
Cys total, мкг/мл	26,5±2,5	40,2±7,4*	31,1±5,1*  **
Cys free, мкг/мл	17,2±2,1	25,4±5,3*	14,5±5,3*  **
Cys-S-S-Cys	8,1±1,5	15,3±3,5*	16,5±4,1*  **
Cys free/Cys-S-S-Cys	2,1	1,7*	0,7*  **

Примечание: * -  достоверность различий по сравнению с контролем; **- достоверность различий между 2 и 3группами / Note: * - significance of differences compared with the control; ** - Reliability of differences between groups 2 and 3;

В системе глутатиона также происходили существенные изменения. Глутатион является наиболее распространенным внутриклеточным антиоксидантом, нарушение регуляции которого приводит к различным патологическим состояниям [7, 8]. Существуют доказательства (invitro и в клинических испытаниях) того, что изменение уровня глутатиона ведет к дисфункции β-клеток поджелудочной железы и принимает участие в патогенезе отдаленных осложнений сахарного диабета. Обычно около 99% внутриклеточного глутатиона существует в восстановленной форме [9, 10].

Уровень общего глутатиона в эритроцитах в контрольной группе составил 788±147 мкг/мл, в группе с ДР этот показатель составил 631±70 мкг/мл, что  было на 20% ниже по сравнению с контролем. В группе с ангиопатией сосудов нижних конечностей общий глутатион составил 433±35 мкг/мл, что на 45% было ниже исходного уровня. Уровень свободного глутатиона также снижался и составил 752±146 мкг/мл в группе контроля, в группе с ДР - 576±67 мкг/мл, что на 21,5% было ниже чем в контрольной группе. В группе с патологией сосудов нижних конечностей этот показатель был значительно снижен (на 46 %) и  составил  342±36 мкг/мл. Уровень окисленного глутатиона при диабетической ретинопатии увеличился (на 52%), при ангиопатии  нижних конечностей резко возрастал (на 70%,) что свидетельствовало об активации перекисного окисления липидов в условиях хронической гипергликемии.

Коэффициент GSH/GSSG, характеризует антиоксидантный потенциал клеток и тканей. В контрольной группе коэффициент составил – 20, в группе с ДР был в 2 раза меньше – 11, в группе с диабетической ангиопатией сосудов нижних конечностей - всего 6. Это доказывает истощение антиоксидантной системы внутри клетки, при прогрессировании осложнений  сахарного диабета.

GSH и GSSG отражают не только окислительный стресс, но и изменения в окислительно-восстановительном процессе и дает возможность осуществлять контроль за ним. Полученные данные показывают, что окислительно-восстановительное состояние GSH/GSSG изменяется в зависимости от различных видов осложнений СД 2типа. Таким образом, тиол/дисульфид окислительно-восстановительное состояние, по сути, может играть центральную роль в регуляции функций клеток «табл. 2»

Таблица 2

Table 2

Уровень различных фракций глутатиона в эритроцитах / The level of the various fractions of glutathione in erythrocytes

Показатели мкг/мл	Контроль	Диабетическая ретинопатия	Диабетическая ангиопатия нижних конечностей
GSH total, мкг/мл	788±147	631±70*  **	433±35*  **
GSH free, мкг/мл	752±146	576±67*	342±36*  **
GSSH	36±10	55±11 *	91±17 *  **
GSH/GSSG	20	11*	6*  **

Примечание: * -  достоверность различий по сравнению с контролем; **- достоверность различий между 2 и 3группами / Note: * - significance of differences compared with the control; ** - Reliability of differences between groups 2 and 3;

Выводы.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при развитии сосудистых осложнениях СД 2 типа страдает как антиоксидантный потенциал плазмы, так и непосредственно клетки, что  выражается в значимом уменьшении восстановленных форм определяемых показателей. При прогрессировании заболевания и наличии диабетической ангиопатии коэффициенты Cysfree/Cys-S-S-Cys и GSH/GSSG достоверно отличаются от таковых в группе контроля. Опираясь на это, можно с уверенностью говорить о том, что у пациентов с СД 2типа необходима полная оценка антиоксидантной системы, с изучением  различных фракций не только глутатиона, но и цистеина для своевременной фармакологической коррекции и профилактике преждевременного развития осложнений.

About the authors

Nadezhda Anatol'evna Shemyakina

Chita State Medical Academy

Author for correspondence.
Email: shemyakina86@list.ru

Assistant of the Department of General Surgery

Russian Federation, Gorkogo Str. 39a, Chita-city 672090, Russia.

Alena Vladimirovna Ermolina

PHI Road Clinical Hospital. Chita-2,«Russian Railways»

Email: ne-ni-ka@mail.ru
Physician Ophthalmologist Russian Federation, Lenina Str.4, Chita-city 672010, Russia

Evgeny Vladimirovich Namokonov

Chita State Medical Academy

Email: namokonovev@mail.ru
MD, Professor, Head of Department of General Surgery Russian Federation, Gorkogo Str. 39a,Chita-city 672090, Russia

References

Supplementary files